傅奇，林俊杰，馮亞棟，肖玉娟

(廈門華廈學院，福建 廈門，361024)

解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是芽孢桿菌屬的一種具有重要研究價值的菌種，在發(fā)酵工業(yè)中可用于生產(chǎn)淀粉酶[1]、蛋白酶[2-3]、纖維素酶[4]等多種工業(yè)用酶，此外還可以表達幾丁質(zhì)酶[5]、伊枯草菌素[6-7]等具有重要研究價值的生物活性物質(zhì)。但由于芽胞桿菌屬中各菌種間保守序列高度相似，無法單獨依靠常用的16S rDNA/RNA測序來準確定位到種, 通常需要結(jié)合生理生化鑒定[8-9]，或者其他序列，如5′端16S-23S ITS核苷酸序列[10]、gyrB基因[11]、gyrA[12]甚至全基因序列[13-14]進行分析。CHEN等[15]、XU等[16]在篩選解淀粉芽胞桿菌時，使用16S與gyrA基因分別建樹的方法進行鑒定；LIM等[17]采用16S序列比對結(jié)合API系統(tǒng)鑒定1株產(chǎn)廣譜細菌素的解淀粉芽胞桿菌；NEL等[18]采用16S rDNA擴增片段限制性內(nèi)切酶分析與rpoB基因建樹結(jié)合的方法，區(qū)分并鑒定南非制糖廠中篩選得到的解淀粉芽胞桿菌與枯草芽胞桿菌。鑒定方法較為繁瑣，目前還沒有通用、簡便、快速的鑒定方法。

gyrB基因編碼DNA促旋酶的B亞單位，在細菌中廣泛存在，序列相對保守，但進化速度快于16S，目前在細菌鑒定中的使用逐漸增加[19]，積累了較為豐富的比對信息，但單獨使用時部分芽胞桿菌也難以準確定位，而16S與gyrB序列分別比對建樹的方法容易出現(xiàn)進化樹結(jié)構(gòu)沖突，干擾定位的情況。利用16S與gyrB基因聯(lián)合建樹，以較少的序列數(shù)和進化樹數(shù)實現(xiàn)對篩選菌株快速鑒定的方法，可提高數(shù)據(jù)的利用率，減少數(shù)據(jù)沖突，為芽胞桿菌種群的分子生物學鑒定方法開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 土壤樣本

土壤樣本，采集自廈門同安國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)竹壩農(nóng)場。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱生物科技有限公司；苯丙氨酸脫氨酶鑒定管、MR-VP鑒定管、SIM培養(yǎng)基(用于硫化氫和吲哚試驗)等，青島海博生物科技有限公司。

細菌基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、聚合鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)試劑，生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn)；16S通用引物27F/1492R、gyrB擴增引物UP-1/UP-2r、gyrB測序引物UP-1S/UP-2Sr[20],生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Aeris-bg096PCR儀，新加坡ESCO公司；HE99核酸電泳儀，美國GE公司；211B搖床，上海蘇坤公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱，上海一恒公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本采集

于農(nóng)場蔬菜種植區(qū)取土壤25 g加入225 mL蛋白胨生理鹽水稀釋均質(zhì)后稀釋涂布營養(yǎng)瓊脂平板，30 ℃培養(yǎng)24 h，取單菌落進行純化。

1.2.2 16S與gyrB序列提取

用細菌基因組DNA抽提試劑盒，提取菌株的總DNA；分別用16S與gyrB引物擴增，所得PCR產(chǎn)物電泳純化后，送由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

16S擴增條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

gyrB擴增條件[20]：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.3 16S與gyrB序列比對與進化分析

將測序結(jié)果在Genbank進行比對。為保障數(shù)據(jù)的準確性，取與受試菌gyrB序列相似度較高的前1 000個序列中，來源于各菌種保藏中心菌株的序列進行比對，包括ATCC、BCRC、CGMCC、CIP、CECT等。下載相似菌株的16S與gyrB序列、分別用BioEdit[21]和Clustal X[22]進行比對和編輯，取有效區(qū)間，分別試驗單獨使用16S序列、單獨使用gyrB序列和使用16S與gyrB線形拼接序列建樹[23]，采用最大簡約算法，用Paup*4.0構(gòu)建進化樹[24-25]，選擇大腸桿菌ATCC 25922[26]作為外群。

1.2.4 生理生化驗證

參考《伯杰細菌鑒定手冊》[27]進行驗證。

1.2.5 聯(lián)合建樹方法適用性分析

為分析16S與gyrB基因聯(lián)合建樹的方法是否適用于其他解淀粉芽胞桿菌的鑒定，于Genbank下載16S與gyrB基因均可得的解淀粉芽胞桿菌序列，按照上述方法進行序列拼接。選擇《伯杰細菌鑒定手冊》[27]中芽胞桿菌屬模式菌株，于Genbak和EZBiocloud下載16S和gyrB序列，選擇大腸桿菌ATCC 25922作為外群，構(gòu)建進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離純化

從土壤中篩選得到1株革蘭氏陽性桿菌，產(chǎn)芽胞，菌落白色、干燥、表面粗糙，編號為HX2016004。

2.2 16S與gyrB基因測序

PCR擴增所得16S序列有效區(qū)共1 436 bp，gyrB序列有效區(qū)共1 207 bp。

2.3 序列比對與進化樹構(gòu)建

16S序列比對結(jié)果中，高相似度菌株過多，且多數(shù)菌株無法獲得更多的遺傳標記序列；而gyrB序列比對結(jié)果中，多數(shù)菌株同時可獲取16S序列，因此，以gyrB相似菌株作為建樹群，下載16S與gyrB基因序列，如表1所示，比較分別使用16S、gyrB和16S與gyrB線形拼接序列建樹結(jié)果。

16S比對后去除頭尾不整齊片段，保留中心區(qū)域1 467 bp(含gap)；gyrB比對后去除頭尾不整齊片段，保留中心區(qū)域1 175 bp(含gap)。構(gòu)建進化樹如圖1所示，A樹基于16S序列構(gòu)建(圖1-a)，b樹基于gyrB序列構(gòu)建(圖1-b)，c樹基于16S與gyrB拼接序列構(gòu)建(圖1-c)，計算次數(shù)為1 000，參數(shù)如表2所示。

注：*表示Bacillus_velezensis為Bacillusamyloliquefaciens的異名[28-29]

表2 基于16S與gyrB序列的進化樹參數(shù)表Table 2 Parameters of phylogenetic trees based on the combined sequences of 16S and gyrB

由圖1可知，僅使用16S序列構(gòu)建的進化樹a分枝自展值低，無法準確定位HX2016004菌株的族群；僅使用gyrB序列構(gòu)建的進化樹b較a整體分枝自展值高，但一致性指數(shù)(consistency index，CI)相對較低，且與a樹存在較大的結(jié)構(gòu)沖突；使用16S與gyrB拼接序列構(gòu)建的進化樹c結(jié)構(gòu)與b一致，表明建樹群中16S的差異較小，不足以影響分類結(jié)構(gòu)，HX2016004菌株與解淀粉桿菌聚合在一枝，自展值為94，表明該菌株為解淀粉芽胞桿菌可能性高。c樹中BacillussubtilisATCC 13952的進化關(guān)系存在疑問，有待進一步分析，但不影響HX2016004菌株的鑒定。

a-基于16S的進化樹；b-gyrB基因的進化樹； c-基于16S與gyrB基因的進化樹
圖1 HX2016004菌株基于16S與gyrB序列的進化樹
Fig.1 Phylogenetic trees about HX2016004 based on sequences of 16S andgyrB

2.4 生理生化驗證

菌株HX2016004生理生化特征如表3所示，與《伯杰細菌鑒定手冊》中的解淀粉芽胞桿菌特征吻合，與進化分析結(jié)果一致，命名為BacillusamyloliquefaciensHX2016004。

表3 菌株HX2016004生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of HX2016004

注：+代表革蘭氏染色呈陽性；-代表革蘭氏染色呈陰性

2.5 聯(lián)合建樹方法適用性

Genbank中16S與gyrB序列同時可得，且鑒定結(jié)果較為可靠的解淀粉芽胞桿菌菌株共有37株，另選擇親緣關(guān)系較近的芽胞桿菌屬其他菌種模式菌株16株，拼接16S與gyrB基因序列后構(gòu)建進化樹如圖2所示。其中所有的解淀粉芽胞桿菌很好的聚合在一簇，與親緣關(guān)系相近菌種Bacillussubtilis、Bacilluslicheniformis、Bacilluspumilus具有較高的種間自展值，分類結(jié)構(gòu)可靠。也就是說，如這37株菌中的任意1株菌種還未鑒定的情況下，利用該方法建樹時均與其他36株解淀粉芽胞桿菌聚合在1枝，可準確鑒定為解淀粉芽胞桿菌。表明16S與gyrB基因聯(lián)合建樹的方法適用于已知的37株解淀粉芽胞桿菌鑒定，可以預測該方法在解淀粉芽胞桿菌鑒定中具有普適性。

圖2 Genbank已知菌株基于16S與gyrB序列的進化樹
Fig.2 Phylogenetic tree based on sequences of 16S andgyrBin Genbank

3 結(jié)論

利用16S與gyrB基因聯(lián)合建樹的方法，課題組快速將1株從土壤中篩選得到的芽胞桿菌HX2016004準確鑒定為解淀粉芽胞桿菌。該方法中使用的引物均為通用引物，只需要1次擴增即可得到16S與gyrB基因序列，測序量小，時間短，數(shù)據(jù)利用率高；與多基因分別建樹的方法相比，可避免進化樹結(jié)構(gòu)之間的沖突和數(shù)據(jù)紊亂，提高了進化樹準確性，適用于16S序列高度相似的菌群鑒定。經(jīng)驗證，該方法在解淀粉芽胞桿菌的鑒定中具有較普遍的適用性，課題組下一步將繼續(xù)研究該方法在其他菌群鑒別中的有效性。