黃荻萱，李國輝，毛銀，趙運英，周勝虎，鄧禹*

1(江南大學(xué)，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

丁二胺，又稱腐胺，是原核和真核生物中常見的二元胺之一[1-2]，具有重要的工業(yè)價值[3]，被廣泛用作生物塑料(如尼龍46)、藥物、殺菌劑、表面活性劑等產(chǎn)品的原材料[4-7]。截止2006年，歐洲丁二胺的年產(chǎn)量約為10 000 t，市場價值超過1 600歐元/t[8-9]，預(yù)計未來仍將高速增長[10]。目前，工業(yè)上丁二胺的合成主要依靠化學(xué)方法[10]，雖然工藝成熟，但使用了不可再生的石油資源，不符合可持續(xù)發(fā)展的要求，且催化劑價格昂貴，反應(yīng)條件相對苛刻。因此，丁二胺的生物合成得到了廣泛關(guān)注[10-13]。

目的產(chǎn)物的定量測定是開展生物合成研究的基礎(chǔ)。由于缺乏紫外吸收和熒光發(fā)色基團，直接利用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)檢測二胺類物質(zhì)較為困難[14]，因此需要衍生化試劑，如丹磺酰氯進行柱前衍生。然而，發(fā)酵液中除丁二胺外，還存在蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽以及小分子胺等多種含有氨基的物質(zhì)，均能與丹磺酰氯發(fā)生反應(yīng)(圖1)，從而對丁二胺的定量檢測產(chǎn)生干擾。

本研究建立了一種基于校準曲線的檢測方法，成功地對大腸桿菌發(fā)酵液中丁二胺的含量進行了定量測定，為后續(xù)生產(chǎn)菌株的性能評價及丁二胺的生物合成奠定了基礎(chǔ)。

圖1 丹磺酰氯與含氨基物質(zhì)的衍生化反應(yīng)過程
Fig.1 The reaction of dansyl chloride with substances containing amino-group

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)

大腸桿菌MG1655、大腸桿菌BL21(DE3),均為本實驗室保藏。丁二胺生產(chǎn)菌的發(fā)酵實驗在添加了4 g/L葡萄糖的肉湯(super optimal broth，SOB)培養(yǎng)基中進行。SOB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨20.0，KCl 0.186，NaCl 0.5，MgCl2·7H2O 2.03。菌株在37 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

丁二胺鹽酸鹽(putrescine, PUT)標準品、1,7-庚二胺(1,7-diaminoheptane, HEP)，Sigma Aldrich；內(nèi)標物1,6-己二胺鹽酸鹽(1,6-diaminohexane, HEX)、高效液相色譜級乙腈，麥克林；衍生化試劑丹磺酰氯，阿拉丁。

1.3 儀器與設(shè)備

高效液相色譜體系采用安捷倫1260 Infinity Ⅱ，配備安捷倫1260 VWD檢測器(G7114A)、安捷倫1260進樣器(G7129A)以及安捷倫1260泵(G7111A)。樣品使用安捷倫porpshell 120EC-C18柱(4.6 mm×150 mm，粒徑4 μm)進行分離。

液相質(zhì)譜分析采用Waters-MALDI-SYNAPT Q-TOF MS，聯(lián)用Waters-Acquity-HPLC色譜儀和PDA檢測器(200～500 nm)。樣品在BEH C18柱(2.1 mm×150 mm，粒徑1.7 μm)上于45 ℃條件下進行分離，流動相A和B分別為乙腈(體積分數(shù)為100%)和甲酸(體積分數(shù)為0.1%)。流速為0.3 mL/min，梯度洗脫程序等參數(shù)見參考文獻[15]。

1.4 實驗方法

1.4.1 二元胺標準品及發(fā)酵液的衍生化

二元胺標準品母液(PUT、HEX和HEP)質(zhì)量濃度為10 g/L，使用時稀釋。丹磺酰氯衍生二元胺的操作如下[16]：在500 μL的二元胺標準品或待測樣品中加入等體積飽和NaHCO3溶液，使用飽和NaOH調(diào)節(jié)pH值至10，加入足量溶解于丙酮的衍生化試劑丹磺酰氯并混合均勻，60 ℃避光水浴30 min后使用2 mL無水乙醚萃取10 min，收集上層有機相，萃取操作重復(fù)2次。混合2次收集到的萃取物，N2吹干除去乙醚后將衍生物溶解于500 μL乙腈溶液中，0.22 μm濾膜過濾后HPLC檢測。上述待測樣品由發(fā)酵液樣品12 000 r/min離心10 min后取500 μL上清液并添加5 μL HEX(10 g/L，終濃度為100 mg/L)和5 μL HEP(10 g/L，終濃度為100 mg/L)后得到。

1.4.2 二元胺衍生物的高效液相色譜分析

在C18柱上進行二元胺丹磺酰氯衍生物的高效液相色譜分離，溫度為30 ℃，紫外檢測波長為254 nm，進樣量為10 μL，流動相A為超純水，流動相B為高效液相色譜級乙腈，流動相均經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后使用。梯度洗脫程序設(shè)置為0～4 min，55%～70%B；4～6.7 min，70%B；6.7～12 min，70%～95%B；12～12.6 min，95%B；12.6～13.5 min，95%～55%B；13.5～16 min，55%B，總流速0.7 mL/min。

1.4.3 校準曲線的繪制

將SOB培養(yǎng)基中酵母粉的質(zhì)量濃度分別設(shè)置為5、10、15、20、25、30、35、40 g/L，模擬不同時期發(fā)酵液中干擾物質(zhì)含量的動態(tài)變化。在含5 g/L酵母粉的SOB培養(yǎng)基中，分別加入25、50、100、150、200 mg/L PUT與固定質(zhì)量濃度的內(nèi)標物HEP(100 mg/L)。經(jīng)衍生化反應(yīng)后，利用高效液相色譜法測定上述體系中PUT和HEP的峰面積。隨后，將上述操作在含有10、15、20、25、30、35、40 g/L酵母粉的SOB培養(yǎng)基體系中重復(fù)進行。相似地，用HEX代替HEP作為內(nèi)標，重復(fù)進行實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬發(fā)酵液體系中二元胺標準品的測定

由于缺乏紫外吸收和熒光發(fā)色基團，難以直接使用紫外或熒光檢測器檢測二元胺，因此本研究中選擇丹磺酰氯[17-18]作為衍生化試劑進行實驗。丁二胺衍生物和內(nèi)標衍生物在超純水體系中的分離效果如圖2所示。結(jié)果表明，所有被測二元胺均能通過梯度洗脫程序完全分離。PUT(峰1)、HEX(峰2)和HEP(峰3)的保留時間分別為9.11、10.63和11.44 min。

峰1-200 mg/L丁二胺的丹磺酰氯衍生物；峰2-100 mg/L 1,7-庚二胺的丹磺酰氯衍生物；峰3-100 mg/L 1,6-己二胺的丹磺酰氯衍生物 A-溶解于超純水中；B-溶解于含有5 g/L酵母粉的SOB培養(yǎng)基中；C-溶解于含有40 g/L酵母粉的SOB培養(yǎng)基中
圖2 丹磺酰氯衍生化丁二胺、1,7-庚二胺、1,6-己二胺標準品的高效液相色譜圖
Fig.2 The HPLC chromatogram of PUT, HEX, HEP standards with Dansyl chloride as derivative reagent

2.2 發(fā)酵液中丁二胺檢測校準曲線的構(gòu)建

將200 mg/L PUT分別溶于超純水和含5 g/L酵母粉的SOB培養(yǎng)基中，同時加入100 mg/L HEX和HEP作為內(nèi)標物，檢測后發(fā)現(xiàn)， HEX和HEP的峰面積分別比超純水中減小33%和11%(圖2-B)。當酵母粉的質(zhì)量濃度為40 g/L時，HEX和HEP的峰面積分別比超純水中減小57%和46%(圖2-C)。結(jié)果表明，當足量衍生化試劑存在時，酵母粉中可能含有某些與二元胺結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，對二元胺的檢測產(chǎn)生影響，且影響作用均隨酵母粉濃度的增加而增強。因此，可以利用內(nèi)標物受到的干擾，指示待測物質(zhì)丁二胺所受影響，消除現(xiàn)有檢測方法的偏差。

為了探究影響規(guī)律，在含有不同濃度酵母粉(0～40 g/L)的模擬發(fā)酵液體系中加入100 mg/L HEP(或HEX)和適量的PUT(50～200 mg/L)。經(jīng)丹磺酰氯衍生化后，用高效液相色譜法測定PUT和HEP(或HEX)的峰面積。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當酵母粉濃度為定值時，單位濃度內(nèi)標HEP峰面積與單位濃度PUT峰面積之間的比值為定值，隨酵母粉濃度的升高，上述比值逐漸減小，定義該比值為轉(zhuǎn)換系數(shù)Kput-hep，繪制HEP峰面積、酵母粉濃度、Kput-hep三者間關(guān)系曲線如圖3-A和3-B所示。同樣地，當酵母粉濃度為定值時，單位濃度內(nèi)標HEX峰面積與單位濃度PUT峰面積的比值為定值，隨著酵母粉濃度的增加，上述比值逐漸減小，定義該比值為轉(zhuǎn)換系數(shù)Kput-hex，繪制HEX峰面積、酵母粉濃度、Kput-hex三者間關(guān)系曲線如圖3-C和3-D所示。在檢測微生物發(fā)酵液樣品中的丁二胺含量時，只需在樣品中加入100 mg/L HEP(或HEX)作為內(nèi)標，根據(jù)HEP(或HEX)峰面積，從關(guān)系曲線A和B(或關(guān)系曲線C和D)中確定該體系下的轉(zhuǎn)化系數(shù)Kput-hep(或Kput-hex)，利用內(nèi)標峰面積對丁二胺峰面積進行校準，即得到丁二胺的實際產(chǎn)量，從而消除體系對丁二胺檢測的干擾。

2.3 校準方法的準確性及可行性評價

在含有5 g/L酵母粉的SOB培養(yǎng)基中，分別添加25、50、100、150、200 mg/L丁二胺的待測樣品，經(jīng)內(nèi)標HEP校準計算后得到對應(yīng)的丁二胺含量檢測值為26.22、 50.63、 99.68、 147.48、 191.82 mg/L，誤差分別為4.890%、 1.254%、-0.317%、-1.677%、-4.090%。經(jīng)內(nèi)標HEX校正后得到的丁二胺含量檢測值分別為26.40、 51.91、 96.82、 145.93、 193.07 mg/L，誤差分別為5.602%、 3.813%、-3.178%、-2.717%、-3.464%。此外，在含有10、 15、 20、 25、 30、 35、 40 g/L酵母粉的SOB培養(yǎng)基體系中，分別重復(fù)進行實驗(圖4)?？傮w來看，校準后的丁二胺檢測值與實際值之間的誤差為0.004%～7.959%，回收率為92.04%～107.73%。該方法的檢出限為0.03 mg/L，定量限為0.11 mg/L，可以滿足發(fā)酵液中丁二胺定量檢測的要求。

A-100 mg/L 1,7-庚二胺峰面積與酵母粉濃度的關(guān)系曲線；B-酵母粉濃度與轉(zhuǎn)化系數(shù)Kput-hep的關(guān)系曲線； C-100 mg/L 1,6-己二胺峰面積與酵母粉濃度的關(guān)系曲線；D-酵母粉濃度與轉(zhuǎn)化系數(shù)Kput-hex的關(guān)系曲線
圖3 發(fā)酵液中丁二胺含量測定的校正關(guān)系曲線
Fig.3 The calibration cueve of the calculation method

圖4 校準方法的準確性評價
Fig.4 The evaluation of the calculation method

隨后，將該方法應(yīng)用于生物合成丁二胺的實際檢測中。選擇大腸桿菌MG1655和大腸桿菌BL21(DE3)進行丁二胺發(fā)酵實驗。大腸桿菌BL21(DE3)在SOB培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵24 h可產(chǎn)生0.33 g/L丁二胺，而大腸桿菌MG1655在72 h內(nèi)僅產(chǎn)生0.03 g/L丁二胺(圖5)，因此前者可作為出發(fā)菌株用于后續(xù)的研究。利用液質(zhì)聯(lián)用-四級桿-飛行時間質(zhì)譜法(liquid chromatography mass spectrometry with quadrupole time-of-flight，LCMS-Q-TOF)進一步鑒定大腸桿菌BL21(DE3)的發(fā)酵液樣品(圖6)，發(fā)現(xiàn)了丁二胺的2個特征碎片([M+H]+89.1和產(chǎn)物離子m/z72.1)[19-20]，證實大腸桿菌BL21(DE3)發(fā)酵積累的產(chǎn)物為丁二胺，表明上述方法成功鑒定了不同菌株的丁二胺生產(chǎn)能力，為進一步的研究奠定了基礎(chǔ)。

圖5 大腸桿菌MG1655和BL21(DE3)在SOB培養(yǎng)基中 發(fā)酵產(chǎn)丁二胺情況
Fig.5 The production of putrescine byE.coliMG1655 andE.coliBL21(DE3) in SOB medium

A-丁二胺溶于超純水色譜圖；B-丁二胺溶于超純水質(zhì)譜圖；C-丁二胺溶于SOB培養(yǎng)基色譜圖；D-丁二胺溶于SOB培養(yǎng)基質(zhì)譜圖； E-大腸桿菌BL21(DE3)在SOB培養(yǎng)基中產(chǎn)丁二胺色譜圖；F-大腸桿菌BL21(DE3)在SOB培養(yǎng)基中產(chǎn)丁二胺質(zhì)譜圖； G-空白SOB培養(yǎng)基色譜圖；H-空白SOB培養(yǎng)基質(zhì)譜圖
圖6 丁二胺的LC-MS定性檢測(前體離子[M+H]+89.1和產(chǎn)物離子m/z72.1)
Fig.6 Qualitative determination of putrescine by LC-MS

3 結(jié)論

本研究提供了一種定量測定發(fā)酵液體系中丁二胺含量的方法，在傳統(tǒng)丹磺酰氯柱前衍生HPLC檢測丁二胺方法的基礎(chǔ)上進行了改進，采用內(nèi)標與校準曲線相結(jié)合，對高效液相色譜法檢測出的丁二胺含量進行校準，消除了干擾成分的影響。該方法適用于丁二胺生物合成過程中產(chǎn)物的定量分析，可用于指導(dǎo)丁二胺生產(chǎn)菌株的篩選和構(gòu)建。此外，該方法也可應(yīng)用于復(fù)雜體系中多種二元胺的含量測定。