劉振宇，岳喜軍

（1.濟南市食品藥品檢驗檢測中心，山東濟南 250000；2.東平縣沙河站鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院，山東泰安 271508）

目前，人口老齡化現(xiàn)象已成為世界各國共同面對的難題之一。據(jù)統(tǒng)計，世界上人口老齡化最嚴重的3個國家分別是日本、德國和意大利，老年人口的比重都在21%以上。我國人口老齡化的問題亦日趨嚴重，從2018年數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析來看，我國已有六省市進入深度老齡化，這六個省市老齡化程度由高到低分別是遼寧省、上海市、山東省、四川省、重慶市和江蘇省，目前遼寧省65歲以上人口占比為15.17%，為全國最高。因此，關于中老年人的健康保健，任重而道遠。

隨著年齡的增長，機體免疫力逐漸降低、記憶力減退等癥狀是存在于中老年人群中的普遍現(xiàn)象，嚴重影響了機體的正常功能?，F(xiàn)代醫(yī)學藥理學研究表明，機體免疫力降低會嚴重加速機體的衰弱過程，降低其對疾病的抵抗能力，從而使機體易受外界環(huán)境的變化而患病；同樣，機體的記憶力減退，會致使機體逐漸發(fā)展至老年癡呆癥等嚴重癥狀。

因此，為了改變現(xiàn)狀，保護中老年人群的健康，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學藥理學研究理論，現(xiàn)以二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）、磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）、蝦青素（Astaxanthin，ASTA）為原料制得復方ASTA制劑，其既能改善記憶又能增強免疫力。其中，原料PS、DHA均為國家批準公布的新資源食品[1-2]，同被譽為新興的“智能營養(yǎng)素”[3-6]，既能使細胞壁保持柔韌，同時能夠促進增強傳送大腦信號的神經(jīng)遞質(zhì)的速率，從而達到促進大腦快速高效運轉(zhuǎn)的效果，激發(fā)機體大腦處于活化狀態(tài)，同時能增強免疫力。原料ASTA為類胡蘿卜素的一種，是一種較強的天然抗氧化劑[7]，能提高機體的免疫功能，同時能提高脾細胞產(chǎn)生抗體的能力，達到增強機體T細胞功效的作用，刺激免疫球蛋白的產(chǎn)生，同時改善記憶力[8]。三者原料配伍，相輔相成，共同奏效?，F(xiàn)對該復方制劑產(chǎn)品功能及安全性等方面進行相關的動物試驗研究。

1 材料與方法

1.1 樣品

復方DHA/PS/ASTA糖果，0.5 g/粒（組方為：PS 0.10 g、DHA 0.15 g、ASTA 0.04 g，輔料 0.21 g）；每日2次，每次2粒。每人每日推薦量為2.0 g。

1.2 試驗動物

試驗動物由山東大學動物試驗中心提供的健康SPF級昆明種雌、雄小鼠、Wistar大鼠，生產(chǎn)許可證號為SCXK（魯）20130009。試驗動物使用許可證號為SYXK（魯）20100011號。試驗動物飼料生產(chǎn)許可證SCXK（京）2014-0008。飼養(yǎng)環(huán)境為屏障級。試驗環(huán)境溫度（22±2）℃，相對濕度50%±10%。

1.3 儀器設備

儀器設備、試驗裝置均參考《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003年版）[9]。

1.4 試驗過程

1.4.1 改善記憶力功能動物試驗

1.4.1.1 跳臺試驗

將雄性小鼠40只（體重25～32 g），隨機分為空白對照組和 0.17 g/kg.bw、0.33 g/kg.bw、0.66 g/kg.bw三個受試物劑量組，每組10只，受試物劑量分別相當于人體每日推薦量的5倍、10倍、20倍，三個劑量組每天灌胃給予受試物，連續(xù)給樣30 d后，進行跳臺訓練試驗。將各組小鼠撫摸幾下后放入小鼠跳臺測試箱中，讓其適應30 min。調(diào)節(jié)電壓為32 V，開始試驗，對小鼠進行電刺激，在訓練期間通電小鼠跳下平臺在箱底不斷被電擊，這個過程中小鼠獲得記憶。24 h后檢測其記憶力，重復前操作，此時測試儀記錄小鼠第一下跳下平臺的時間即潛伏期和5 min內(nèi)跳下平臺的次數(shù)即測試期的錯誤次數(shù)，作為記憶保持成績。

1.4.1.2 水迷宮測試試驗

動物選擇、試驗分組以及受試物劑量、途徑、時間均同跳臺試驗一樣。給受試物30 d后開始進行水迷宮試驗，訓練期間繼續(xù)給予受試物，每天訓練1次，連續(xù)5 d，第1 d訓練前將小鼠放在梯子附近，使其自動爬上3次，以后每次訓練前將小鼠放在梯子附近，使其自動爬上1次。第1 d訓練時，用擋板在A處擋住，進行訓練。第2 d從B處開始，此路程訓練3次，80%的動物到期達終點。第5 d從起點S開始訓練，最后以5 d的總學習成績進行評價（即各組2 min內(nèi)到達終點的動物數(shù)、每組5 d平均錯誤次數(shù)和到達終點的時間）。

1.4.2 動物免疫試驗

將體重25～32 g的小鼠80只，雌雄各半，分為2個免疫大組，每大組40只，每免疫大組小鼠分為正常對照組、0.17 g/kg.bw、0.33 g/kg.bw、0.66 g/kg.bw 三個受試物低、中、高劑量組，劑量分別相當于人體每日推薦量的5倍、10倍、20倍。免疫一組（雌）用于遲發(fā)型變態(tài)反應（DTH）試驗、血清溶血素的測定、抗體生成細胞數(shù)的測定；免疫二組（雄）用于小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗。具體試驗操作參考《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003年版）[9]。

1.4.3 毒理學試驗

1.4.3.1 小鼠急性毒性試驗

采用最大耐受劑量法試驗，選用體重為25～32 g的小鼠20只，雌雄各半。小鼠灌胃前16 h禁食，自由飲水，于第2 d 以 15.0 g/kg灌胃后，連續(xù)觀察14 d，記錄動物中毒癥狀及死亡情況。

1.4.3.2 遺傳毒性試驗

（1）污染物致突變性檢測（Ames試驗）：采用鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四種標準突變型試驗菌株。大鼠肝勻漿S-9采用多氯聯(lián)苯誘導Wistar大鼠，按Ames常規(guī)方法自行制備。劑量組分設5 000μg/皿、1 000μg/皿、200μg/皿、40μg/皿和8 μg/皿5個劑量組，設自發(fā)回變、溶劑對照和陽性對照組，每種菌株每個測試濃度設3個平皿，在加和不加S-9條件下進行試驗。37 ℃培養(yǎng) 48 h，記錄回復突變菌落數(shù)。

（2）小鼠骨髓嗜多染紅細胞（PCE）微核試驗：50只小鼠（雌雄各半，體重25～32 g）隨機分成5組，設 2.5 g/kg.bw、5.0 g/kg.bw 和 10.0 g/kg.bw 三個不同劑量組，1個環(huán)磷酰胺陽性對照組（40 mg/kg.bw）和1個純化水陰性對照組。小鼠按0.02 mL/kg體重灌胃容量，間隔24 h灌胃2次，于末次灌胃后6 h處死動物，制取胸骨髓液，涂片，甲醇固定，染色。鏡檢PCE，每鼠計數(shù)1 000個嗜多染紅細胞，計算微核千分率，以%表示；同時計數(shù)PCE和正染紅細胞的比值（PCE/NCE）。

（3）小鼠精子畸形試驗：50只雄性小鼠（體重25～32 g）隨機分成 5 組，每組 10 只。設 2.5 g/kg.bw、5.0 g/kg.bw和10.0 g/kg.bw三個不同劑量組，另設植物油陰性對照組和環(huán)磷酰胺陽性對照組，受試物按0.02 mL/g體重灌胃容量以灌胃方式給予，連續(xù)5 d，繼之飼養(yǎng)1月，自由攝食、飲水，于35 d頸椎脫臼處死，常規(guī)制片，記錄畸形精子數(shù)，計算精子畸形率。

1.5 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計

對試驗數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，對方差齊者采用t檢驗；如數(shù)據(jù)方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗。應用軟件為 SPSSI 1.5 及 SPSSI 6.0 for Windows。

2 結(jié)果與分析

2.1 改善記憶力動物試驗

2.1.1 跳臺試驗結(jié)果

由表1可知，跳臺試驗中，經(jīng)口給予小鼠不同受試物劑量的受試物30 d，記憶獲得（訓練）過程中，與正常對照組相比，受試物中、高劑量組的平均錯誤次數(shù)均顯著減少（P＜0.05）；重復測驗過程中，與正常對照組相比，受試物高劑量組跳下平臺的潛伏期延長，平均錯誤次數(shù)減少，錯誤反應率顯著降低（P＜0.05）。

2.1.2 水迷宮試驗結(jié)果

由表2可知，水迷宮試驗中，給予小鼠不同劑量的受試物30 d，與正常對照組比較，各受試物劑量組動物到達終點所需的時間顯著縮短（P＜0.05）；平均錯誤次數(shù)顯著減少（P＜0.05）；到達終點的動物數(shù)顯著多（P＜0.05）。

2.2 免疫試驗

2.2.1 對小鼠體重和臟器體重比值的影響

正常對照組和3個劑量組共4個組初始體重的方差分析結(jié)果顯示，在各組間小鼠的初始體重較為均衡，各組均數(shù)間差異均無顯著性（P＞0.05）。給予小鼠不同劑量的受試物制劑30 d，正常對照組和3個劑量組共4個組體重增長值的方差分析結(jié)果顯示，各組均數(shù)間差異無顯著性（P＞0.05），即該受試物對小鼠體重無影響；脾臟體重比值和胸腺體重比值的方差分析結(jié)果顯示，各組均數(shù)間差異無顯著性（P＞0.05），即受試物對小鼠脾臟體重比值和胸腺體重比值均無影響。

2.2.2 受試物對小鼠細胞免疫功能的影響

由表3正常對照組和3個劑量組共4個組的小鼠足跖腫脹度的方差分析結(jié)果顯示，與正常對照組相比，中、高劑量受試物組間有顯著性差異（P＜0.05），由此可知該受試物有提高小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的能力；淋巴細胞增殖能力的方差分析結(jié)果顯示，各組均數(shù)間無顯著性差異（P＞0.05），表明該受試物細胞免疫試驗結(jié)果為陽性。

表1 跳臺試驗結(jié)果

表2 水迷宮試驗結(jié)果

表3 受試物對小鼠免疫功能的影響

與正常對照組相比，受試物組有顯著提高小鼠抗體細胞生成數(shù)的能力（P＜0.05）；抗體積數(shù)的方差分析結(jié)果顯示，各組均數(shù)間比較無顯著性差異（P＞0.05），尚不能認為受試物有提高小鼠血清溶血素水平的能力。由此顯示，體液免疫試驗結(jié)果為陽性。

2.3 毒理學試驗結(jié)果

2.3.1 急性毒性試驗

急性毒性試驗中，14 d試驗期內(nèi)未見動物明顯中毒癥狀和死亡情況。最大耐受量（MTD）法試驗結(jié)果顯示，該受試物對兩種性別小鼠的MTD均＞15.0 g/kg.bw。因此，根據(jù)急性毒性分級標準，該受試物屬實際無毒級。

2.3.2 遺傳毒性試驗

2.3.2.1 Ames試驗結(jié)果

受試物各劑量組對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100和TA102四株試驗菌株，在加與不加S-9時，回變菌落數(shù)均未超過溶劑對照組回變菌落數(shù)的2倍。因此，Ames試驗結(jié)果為陰性。

2.3.2.2 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結(jié)果

陽性對照組微核率與陰性對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；各劑量組微核率與陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。因此，小鼠骨髓PCE微核試驗結(jié)果陰性。

2.3.2.3 小鼠精子畸形試驗結(jié)果

陽性對照組小鼠精子畸形率為6.23%，與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；各劑量組精子畸形率與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。因此，小鼠精子畸形試驗結(jié)果陰性。

3 結(jié)論

在改善記憶力動物試驗中，跳臺試驗和水迷宮試驗的試驗組動物記憶獲得的錯誤反應潛伏期延長，錯誤次數(shù)、錯誤反應率降低，與對照組比較，差異具顯著性；水迷宮試驗組動物到達終點的時間縮短，到達終點的動物數(shù)增加，錯誤次數(shù)減少，與對照組比較，差異亦具顯著性，且訓練及重復測驗結(jié)果一致。由此表明復方DHA/PS/ASTA糖果制劑具有改善記憶的作用。

增強免疫動物試驗中，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的受試物30 d，對小鼠體重增長無不良影響，對小鼠脾臟體重比值和胸腺體重比值無影響，小鼠的體液免疫功能、細胞免疫功能測定結(jié)果均為陽性。結(jié)果表明，復方DHA/PS/ASTA糖果制劑具有增強免疫力的作用。

毒理學試驗中，經(jīng)口急性毒性試驗、遺傳毒性試驗兩階段毒理試驗結(jié)果，可知本品屬無毒級，無遺傳毒性作用，對動物生長發(fā)育無不良影響，其最大未觀察到有害作用劑量大于人體可能攝入量的100倍，由此證明具有安全性，且同時證明DHA、PS、ASTA三者原料配伍具有安全性。