郭寧強(qiáng)

（平羅縣第二中學(xué)，寧夏石嘴山 753400）

枸杞（LyciumbarbarumL.）屬于茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium），通稱(chēng)茨圓或紅果子[1]?？箟难徇^(guò)氧化物酶（Aseorbateperoxidase，APX），也叫維生素C過(guò)氧化物酶，普遍存在于高等植物、真核藻類(lèi)和部分藍(lán)細(xì)菌中，在部分昆蟲(chóng)中也檢測(cè)出APX活性[2]?？箟难徇^(guò)氧化物酶屬于末端氧化酶的一種，在1976年才被Foyer和Halliwell發(fā)現(xiàn)[3]。近十幾年來(lái)，其重要的生理生化功能受到研究者的廣泛關(guān)注。

抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）是一種亞鐵血紅素蛋白[4]，對(duì)底物抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA）有極高的專(zhuān)一性[5]。AsA是植物體內(nèi)合成的一類(lèi)己糖內(nèi)酯化合物，在植物的生長(zhǎng)以及發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，如抗氧化和清除自由基、光合作用和光保護(hù)、細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂以及參與乙烯的合成等[6]。

APX是眾多植物活性氧代謝中非常重要的抗氧化酶之一，不僅是植物葉綠體中清除H2O2的關(guān)鍵酶，還是維生素C代謝中主要的酶類(lèi)。而在植物的光合作用中起到一定的催化作用。經(jīng)相關(guān)研究表明，通過(guò)對(duì)抗壞血酸過(guò)氧化物酶的克隆，可以提高植物的抗逆性和光合作用能力。目前，少見(jiàn)有枸杞抗壞血酸過(guò)氧化物酶的相關(guān)研究報(bào)道，本研究克隆到LbAPX基因cDNA片段，并對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析結(jié)果為進(jìn)一步研究該基因在枸杞中的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

枸杞品種“寧杞1號(hào)”生長(zhǎng)于育新公司試驗(yàn)基地，自然條件生長(zhǎng)，于2015年6—7月采摘花蕾冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。液氮速凍后貯于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

LA-Taq 聚合酶、連接載體 pMD? 19-T Vector，TaKaRa 公司；RNA Plant Extraction Kit DP419，天根公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，天根公司；PrimeScriptTM1 Strand cDNA Synthesis Kit、SMART PCRcDNA Synthesis Kit，Clontech 公司。

1.3 主要儀器

KYC-1102C型恒溫培養(yǎng)搖床，上海浦東物理光學(xué)儀器；高速冷凍離心機(jī)，意大利ALC公司；DTC型PCR儀，西安天隆科技有限公司；Gel doc2000型凝膠成像儀，美國(guó)BIO-RAD公司；DYY-8C型電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 總RNA提取和純化、cDNA第一鏈的合成

1.4.1.1 總RNA的提?。═RIZOL法）

用北京天根公司（TIANGEN）的RNA Plant Extraction Kit DP419試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行提取。

1.4.1.2 RNA的純化與檢測(cè)

為了防止基因組DNA污染，對(duì)總RNA樣品進(jìn)行DNAase I消化和苯酚/氯仿抽提純化。純化后，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳（電泳條件：1×TAE；130 V，15 min），后續(xù)對(duì)總RNA的質(zhì)量進(jìn)行了檢測(cè)。若非常明顯看到28S rRNA和18S rRNA的兩條帶，證明其完整性較好。若出現(xiàn)彌散狀或條帶看不清說(shuō)明總RNA已嚴(yán)重降解。

1.4.1.3 cDNA第一鏈合成

參 照 SMART PCRcDNA Synthesis Kit說(shuō) 明 書(shū) 對(duì)cDNA第一鏈進(jìn)行合成。

1.4.2 LbAPX基因cDNA保守區(qū)片段的克隆

1.4.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)先前枸杞花藥蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，質(zhì)譜鑒定的肽段序列信息，進(jìn)行了數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，通過(guò)對(duì)比番茄、煙草、大豆和棉花等同源基因的氨基酸序列保守區(qū)，采用primer5軟件并設(shè)計(jì)LbAPX引物序列。

上游引物：5'-GGAATATGCAGAGAAGTATGCT GTAGATCAAG-3'。

下游引物：5'-CAAATCTTAAGCTTCCATTAGCT CCACCTC-3'。

1.4.2.2 PCR擴(kuò)增

PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳、染色以及凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.4.2.3 目的片段的回收

PCR目的片段采用TaKaRa公司的Agrose Gel DNA Extraction Kit回收。

1.4.3 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、連接、轉(zhuǎn)化及鑒定

1.4.3.1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

用CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

1.4.3.2 目的基因與T載體連接

回收產(chǎn)物 4 μL、SolutionⅠ 5 μL、pMD18-T Vector 1 μL 混合后離心混勻，在 16 ℃恒溫條件下連接 3 h。

1.4.3.3 轉(zhuǎn)化

連接產(chǎn)物10 μL，DH5α感受態(tài)細(xì)胞50 μL，二者混勻，冰上放置 30 min；隨后 42 ℃熱激 90 s，冰上放 5 min 后加入 200 μL LB 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng) 1 h（110 r/min、37 ℃）；取LB培養(yǎng)液，均勻涂板在LB的固體培養(yǎng)基（100 μg/mL Amp），先正面培養(yǎng) 1 h，再倒置培養(yǎng) 12～16 h（37 ℃恒溫）。

1.4.3.4 鑒定

用1.0%瓊脂糖凝膠來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物，其中陽(yáng)性克隆的菌液送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4.4 LbAPX基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）下載了部分來(lái)源于其他植物的APX類(lèi)蛋白序列信息，經(jīng)過(guò)BioXM2.6軟件進(jìn)行了同源性比對(duì)，用MEGA 4.1軟件對(duì)上述植物的APX基因進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)生分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA完整性檢測(cè)

由圖1可以看出，在0.1%的瓊脂糖凝膠上，RNA泳道無(wú)背景，28S和18S兩條帶的帶型清晰。經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定其A260/A280介于1.8～2.0。表明提取到的枸杞花藥總RNA質(zhì)量較高，可用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄研究。

圖1 枸杞花藥RNA電泳圖

2.2 LbAPX基因cDNA保守區(qū)序列的獲得及同源性分析

2.2.1 LbAPX基因cDNA保守區(qū)序列的獲得

以枸杞花藥cDNA為模板，經(jīng)RT-PCR得到一條大小約為670 bp的特異片斷，如圖2所示。

對(duì)特異片段進(jìn)行回收，隨后連接和轉(zhuǎn)化，進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選及PCR鑒定，鑒定結(jié)果如圖3所示。

圖2 枸杞LbAPX基因PCR

圖3 枸杞LbAPX基因菌液PCR

對(duì)菌液進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果序列如表1所示。該序列長(zhǎng)670 bp，具有完整的ORF。

2.2.2 LbAPX花藥基因cDNA編碼產(chǎn)物的同源性和系統(tǒng)發(fā)生分析

用Blast分析了LbAPX的ORF編碼的氨基酸序列，結(jié)果如圖4。其氨基酸保守結(jié)構(gòu)區(qū)域位于3～145 AA，證明屬APX超基因家族。該氨基酸序列與馬鈴薯植物葉綠體抗壞血酸過(guò)氧化物酶同源性高達(dá)96%。

圖4 LbAPX基因氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域

采用MEGA4.1軟件對(duì)枸杞、馬鈴薯、煙草、棉花和大豆等來(lái)自于不同物種的APX進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果如圖5所示。從系統(tǒng)發(fā)生分析可看到，LbAPX與煙草和馬鈴薯的APX蛋白進(jìn)化關(guān)系最近，與棉花的親緣關(guān)系則相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖5 LbAPX蛋白的進(jìn)化分析

表1 菌液測(cè)序結(jié)果

3 討論與結(jié)論

APX蛋白是一類(lèi)酸性、可溶性蛋白，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的蛋白種類(lèi)約200多種。伴隨克隆技術(shù)的發(fā)展及APX蛋白的cDNA文庫(kù)建立，人們漸漸認(rèn)識(shí)到這是一類(lèi)任何真核細(xì)胞中都普遍存在的蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，APX蛋白在植物中的功能主要集中在植物種子的萌發(fā)、植物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝、物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞周期的調(diào)控等方面。植物中該蛋白克隆已經(jīng)有很多報(bào)道，尤其在對(duì)該蛋白的生理生化功能方面有相關(guān)報(bào)道。通過(guò)克隆技術(shù)，在馬鈴薯和番茄以及油菜植物中可調(diào)節(jié)植物的抗逆性[7-8]。

利用TRIZOL法提取了“寧杞1號(hào)”花藥總RNA，采用 SMART PCRcDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA，并設(shè)計(jì)引物克隆了抗壞血酸過(guò)氧化物酶的cDNA片段。通過(guò)相關(guān)軟件進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，得到了長(zhǎng)度為670 bp的片段和完整的ORF，該ORF長(zhǎng)為456 bp，編碼146個(gè)氨基酸。經(jīng)cDNA編碼產(chǎn)物的同源性和系統(tǒng)發(fā)生分析，表明枸杞LbAPX基因?qū)儆贏PX超基因家族。該氨基酸序列與馬鈴薯的同源性高達(dá)96%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步深入研究LbAPX編碼的蛋白在枸杞中的相關(guān)功能及相應(yīng)的生理生化性質(zhì)奠定了前期基礎(chǔ)。