郭新軍

(西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，陜西 西安 710065)

作為蜂毒的主要活性成分之一[1]，蜂毒肽(Melittin)在蜜蜂體內(nèi)是由其前體——蜂毒溶血肽原(Promelittin)水解而成的[2]，而蜂毒溶血肽原是蜂毒前溶血肽原(Prepromelittin)加工后的產(chǎn)物。蜂毒前溶血肽原包括70個(gè)氨基酸殘基，由信號(hào)肽(第1至第21氨基酸殘基)、低復(fù)雜性區(qū)域(第22至第43氨基酸殘基)和蜂毒肽結(jié)構(gòu)域(第44至第69氨基酸殘基)等構(gòu)成[3]。

利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)蜂毒肽被看作一條有效獲得蜂毒肽的途徑，具有一定應(yīng)用前景。前期我們構(gòu)建了蜂毒前溶血肽原與GST融合表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPMel，并在大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，成功獲得了目的融合蛋白。但由于GST標(biāo)簽自身相對(duì)分子質(zhì)量較大，而目的蛋白又非常小，對(duì)目的片段的純化等可能會(huì)有較大影響。筆者研究考慮到蜂毒前溶血肽原自身具有較大的溶解度，對(duì)細(xì)胞膜的破壞能力較低，嘗試使用分子量較小的His標(biāo)簽，將改造后的蜂毒前溶血肽原基因由重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPMel重構(gòu)到pET-28a(+)載體上，構(gòu)建了pET-28a(+)-PPMel重組質(zhì)粒，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)方面分析，為探討其在原核細(xì)胞中的表達(dá)提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑

實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)蜂毒前溶血肽原基因進(jìn)行了改造并合成了改造后的基因，構(gòu)建了蜂毒前溶血肽原與GST融合表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPMel。相關(guān)材料保存于本實(shí)驗(yàn)室。

實(shí)驗(yàn)所用pET-28a(+)表達(dá)載體、大腸桿菌(E. coli)TOP10感受態(tài)細(xì)胞及T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI等分子生物學(xué)試劑均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蜂毒前溶血肽原基因載體更換 利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI對(duì)原構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPMel進(jìn)行雙酶切，同時(shí)利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI對(duì)載體pET-28a(+)進(jìn)行雙酶切。各酶切體系(50 μL)中均包含反應(yīng)模板4 μg，10×FD Buffer 5 μL，SalI 1 μl(10 U·μL-1)，EcoRI 1 μl(10 U·μL-1)，ddH2O 39 μL。酶切體系置于恒溫水浴鍋中37 ℃條件下反應(yīng)2 h。

回收目的基因片段和酶切后的載體pET-28a(+)，利用T4 DNA連接酶將獲得的目的基因片段與酶切后的載體pET-28a(+)進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pET-28a(+)-PPMel(圖1)。連接體系(20 μL)中包含目的基因片段8 μL，酶切后載體pET-28a(+) 4 μL，10×T4 DNA ligase Buffer 2 μL，T4 DNAigase 1 μL(5 U·μL-1)，ddH2O 補(bǔ)充至20 μL。上述連接混合液置于PCR儀中22 ℃條件下反應(yīng)1 h。

將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含有50 μg·mL-1卡那霉素的平板培養(yǎng)過夜后篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切、電泳鑒定，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.2 目的產(chǎn)物的生物信息學(xué)分析 應(yīng)用ExPASy ProtParam tool(web.expasy.org/protparam/)對(duì)目的融合蛋白產(chǎn)物的理化性質(zhì)進(jìn)行分析[4]。通過SignalP-5.0 Server程序(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對(duì)目的融合蛋白進(jìn)行信號(hào)肽分析[5]。同時(shí)，通過TMHMM Server v.2.0(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)目的融合蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)域分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的酶切檢測(cè)

從大腸桿菌中提取的重組質(zhì)粒，酶切后進(jìn)行電泳檢測(cè)。根據(jù)電泳結(jié)果可知，重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和SalI雙酶切后的產(chǎn)物主要為約5 000 bp和200 bp的兩個(gè)片段(圖2)。片段大小與預(yù)期一致，可知原重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPMel中的蜂毒前溶血肽原基因片段已成功重構(gòu)于新的載體pET-28a(+)上，獲得的酶切片段中，大片段為載體質(zhì)粒，小片段為插入的蜂毒前溶血肽原基因片段。

2.2 重組質(zhì)粒插入片段的測(cè)序結(jié)果

插入片段的測(cè)序結(jié)果與預(yù)定改造后的蜂毒前溶血肽原基因序列一致(圖3)，進(jìn)一步驗(yàn)證了目的基因已成功插入到載體中。序列兩端分別包含EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)，保證了目的片段以正確的方向插入到載體中。

2.3 目的產(chǎn)物的生物信息學(xué)分析

插入載體后的蜂毒前溶血肽原可與載體上的相關(guān)序列連接在一起進(jìn)行融合表達(dá)，且目的基因片段能與pET-28a(+)載體中的前端序列形成正確的讀碼框，起始密碼子來自載體，終止密碼子來自目的基因末端。表達(dá)的融合蛋白包括106個(gè)氨基酸殘基，比設(shè)計(jì)的蜂毒前溶血肽原多36個(gè)氨基酸殘基，包括6個(gè)組氨酸殘基組成的His標(biāo)簽。蜂毒肽序列前的N-G氨基酸殘基構(gòu)成羥胺裂解位點(diǎn)[6]，可作為由融合蛋白獲得蜂毒肽的切割位點(diǎn)(圖4)。該融合蛋白的理論等電點(diǎn)(Theoretical pI)為6.35，帶負(fù)電荷氨基酸殘基10個(gè)，帶正電荷氨基酸殘基8個(gè)，融合蛋白不穩(wěn)定系數(shù)較蜂毒前溶血肽原略有降低。

蜂毒前溶血肽原本身具有信號(hào)肽[3]，在真核細(xì)胞內(nèi)可進(jìn)行分泌表達(dá)。在進(jìn)行融合表達(dá)時(shí)，蜂毒前溶血肽原N末端添加相應(yīng)序列后，融合蛋白沒有明顯信號(hào)肽。信號(hào)肽的這種變化對(duì)于在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)真核細(xì)胞基因的影響有待于進(jìn)一步研究。

蜂毒前溶血肽原融合蛋白存在兩個(gè)跨膜區(qū)，主要在融合蛋白的中間區(qū)域和C末端(蜂毒肽結(jié)構(gòu)域)。

3 討論

蜂毒肽在抗菌、消炎、抗腫瘤、肌肉再生[7～12]等方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值。在利用基因工程方法生產(chǎn)蜂毒肽時(shí)，可考慮用蜂毒前溶血肽原作為表達(dá)的初始產(chǎn)物，進(jìn)一步在體外加工而獲得蜂毒肽。因?yàn)榕c蜂毒肽相比，蜂毒前溶血肽原具有較大的溶解度，且對(duì)細(xì)胞的破壞能力小[13]。

蜂毒前溶血肽原基因全長CDS序列僅213 bp，用人工合成的方法獲得全序列較為方便，且易根據(jù)需要對(duì)基因進(jìn)行改造。合成的基因序列可以根據(jù)需要構(gòu)建到載體上，進(jìn)行復(fù)制、表達(dá)或保存。也可以在需要時(shí)利用酶切和連接技術(shù)更換載體。為了實(shí)現(xiàn)改造后的蜂毒前溶血肽原基因與His標(biāo)簽等序列的融合表達(dá)，我們將原連接于重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPMel中的蜂毒前溶血肽原基因進(jìn)行了換載重構(gòu)，并成功獲得了重組質(zhì)粒pET-28a(+)-PPMel，為進(jìn)一步轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行蜂毒前溶血肽原基因的表達(dá)提供了材料。

通過對(duì)相關(guān)序列的生物信息學(xué)分析，在進(jìn)行融合表達(dá)時(shí)，表達(dá)出的融合蛋白與蜂毒前溶血肽原相比，其理化性質(zhì)、信號(hào)肽等均發(fā)生一定的變化，這種變化對(duì)于其原核表達(dá)的影響有待于進(jìn)一步研究。蜂毒前溶血肽原本身存在2個(gè)跨膜區(qū)，在進(jìn)行原核表達(dá)時(shí)，可能不利于其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。若要減少跨膜區(qū)，可考慮進(jìn)一步對(duì)融合蛋白中間跨膜區(qū)對(duì)應(yīng)的基因序列進(jìn)行改造，而考慮到要保證通過原核表達(dá)產(chǎn)物獲得的蜂毒序列不變，融合蛋白中蜂毒肽結(jié)構(gòu)域的跨膜區(qū)無法去除。獲得的重組質(zhì)粒在進(jìn)行表達(dá)時(shí)，仍需進(jìn)一步摸索條件，以便順利表達(dá)出目的蛋白，為蜂毒肽的生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。