姬虎太，王 敏，曹 勇，馬小飛，姜蘭芳，郝建宇，張定一，李曉麗

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 小麥研究所，山西 臨汾 041000)

小麥籽粒蛋白主要由麥谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白組成，其中麥谷蛋白是影響面團(tuán)粘彈性的主要因素。根據(jù)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)遷移率，將麥谷蛋白分為高分子量谷蛋白亞基(high-molecular-weight glutenin subunit,HMW-GS)和低分子量谷蛋白亞基(low-molecular- weight glutenin subunit, LMW-GS)；其中LMW-GS約占麥谷蛋白總含量的75%左右。研究發(fā)現(xiàn)，LMW-GS對(duì)面團(tuán)延展性、面團(tuán)韌性，谷蛋白大聚體的形成，面粉蒸煮品質(zhì)、烘烤品質(zhì)等都具有重要影響[1～4]；LMW-GS能增加面團(tuán)筋度、改善烘烤品質(zhì)[5]，可以解釋面團(tuán)主要參數(shù)的30%～60%的變異[6]，對(duì)品質(zhì)性狀改良具有重要作用。

LMW-GS基因定位于第一同源染色體的短臂上，即Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)編碼5～10個(gè)LMW-GS基因[7]。由于LMW-GS基因數(shù)目多且組成復(fù)雜，因此開發(fā)相應(yīng)的分子標(biāo)記，對(duì)深入研究小麥LMW-GS研究具有重要意義[9]。目前為止，己經(jīng)研發(fā)出了一些LMW-GS基因的功能標(biāo)記，Wang等[10, 11]對(duì)Glu-A3和Glu-B3位點(diǎn)的基因進(jìn)行鑒定，開發(fā)出特異的STS標(biāo)記，為LMW-GS用于育種提供了簡(jiǎn)便、可靠的檢測(cè)工具。近年來，更多的學(xué)者把改善小麥品質(zhì)性狀的育種途徑轉(zhuǎn)移到LMW-GS研究領(lǐng)域[12, 13]，為小麥品質(zhì)遺傳改良提供了新的思路與方法。

筆者研究旨在通過STS分子標(biāo)記檢測(cè)強(qiáng)筋小麥品種晉麥92號(hào)及其親本品種/系(晉麥33、臨優(yōu)6148)在Glu-A3位點(diǎn)基因類型，從分子水平分析晉麥92號(hào)強(qiáng)筋品質(zhì)來源以及在改善小麥品質(zhì)的潛在價(jià)值，為合理利用強(qiáng)筋小麥種質(zhì)資源，加速優(yōu)質(zhì)專用強(qiáng)筋小麥品種選育，提高小麥加工品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

晉麥92號(hào)、臨優(yōu)6148與晉麥33來源于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所；對(duì)照品種中國春來源于西北農(nóng)林科技大學(xué)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用CTAB法提取基因組DNA。利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，稀釋至終濃度100 ng·uL-1。

1.2.2 STS標(biāo)記檢測(cè) 主要有:

(1)引物合成。根據(jù)王林海等[14]的研究設(shè)計(jì)LMW-GS基因Glu-A3位點(diǎn)的特異性引物(表1)，由北京金瑞斯生物技術(shù)有限公司合成。

(2)PCR擴(kuò)增體系及程序。主要有:

A.PCR反應(yīng)體系為20 uL，包括2×T5 Super PCR Mix(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)，每條引物10 pmol，模板DNA100 ng。

B.PCR擴(kuò)增條件：Glu-A3a為98℃預(yù)變性3 min；98℃變性35 s，63℃退火35 s，72℃延伸90 s，15個(gè)循環(huán)；98℃變性35 s，59℃退火35 s，72℃延伸90 s，20個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。Glu-A3b、ac、d、e、f和g為98℃預(yù)變性3 min；98℃變性35 s，59℃～63.5℃退火35 s，72℃延伸 90 s，37個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

(3)瓊脂糖凝膠電泳。使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，緩沖液體系為1×TBE溶液，120V電壓電泳60 min，GeneGreen核酸染料(天根生化科技北京有限公司)染色，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)觀察、照相。

表1 Glu-A3位點(diǎn)等位變異特異引物

2 結(jié)果與分析

利用GluA3位點(diǎn)的7對(duì)特異性引物對(duì)晉麥92號(hào)、親本品種/系(晉麥33、臨優(yōu)6148)和對(duì)照品種中國春的基因組DNA進(jìn)行STS分子標(biāo)記檢測(cè)，有2對(duì)引物即Glu-A3aF/R、Glu-A3acF/R擴(kuò)增出特異片段(圖1、圖2)。對(duì)照品種中國春擴(kuò)增出573bp和596bp大小的目的條帶；晉麥92、臨優(yōu)6148號(hào)僅擴(kuò)增出573bp目的條帶，未擴(kuò)增出596bp目的條帶；晉麥33未擴(kuò)增出目的條帶；說明晉麥92號(hào)和臨優(yōu)6148含有Glu-A3c基因。

3 結(jié)論與討論

長期以來，我國的小麥育種工作是以提高產(chǎn)量和改良抗病性為主，對(duì)品質(zhì)的改良不夠重視[15]。隨著生活水平提高和膳食結(jié)構(gòu)改變，面包類食品需求量快速增長，專用強(qiáng)筋小麥的供需差距較大，嚴(yán)重依賴于進(jìn)口[16]。因此，加強(qiáng)優(yōu)質(zhì)專用強(qiáng)筋小麥品種選育、推廣及生產(chǎn)，對(duì)促進(jìn)小麥供給側(cè)改革、保證國家糧食安全、提高群眾生活水平具有重要意義。晉麥92號(hào)是山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所選育的強(qiáng)筋小麥品種，選自親本組合臨優(yōu)6148/晉麥33號(hào)，綜合性狀良好，其優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋性狀與臨優(yōu)6148有關(guān)，高產(chǎn)抗旱性狀與晉麥33號(hào)有關(guān)。2012年經(jīng)農(nóng)業(yè)部谷物品質(zhì)檢驗(yàn)測(cè)試中心測(cè)定，其綜合指標(biāo)超過國家一等強(qiáng)筋小麥品質(zhì)指標(biāo)。因此，晉麥92號(hào)可以作為強(qiáng)筋小麥種質(zhì)資源，在改善小麥品質(zhì)育種中提供價(jià)值。

隨著LMW-GS基因序列的克隆，Glu-A3和Glu-B3位點(diǎn)上相應(yīng)的特異性分子標(biāo)記已經(jīng)開發(fā)[10, 11]，為LMW-GS等位變異的分子標(biāo)記鑒定提供了基礎(chǔ)。采用Wang[10]等開發(fā)出的Glu-A3位點(diǎn)特異引物，可以準(zhǔn)確、快速地鑒定Glu-A3位點(diǎn)的變異類型，提高LMW-GS位點(diǎn)等位變異分子標(biāo)記輔助選擇的效率。LMW-GS各位點(diǎn)內(nèi)的不同等位基因?qū)ζ焚|(zhì)效應(yīng)的影響差異較大，Gupta[8]等認(rèn)為Glu-A3位點(diǎn)各等位基因?qū)γ娼顝?qiáng)度貢獻(xiàn)為Glu-A3b>Glu-A3c > Glu-A3e。本研究結(jié)果表明晉麥92號(hào)含有Glu-A3c等位變異，由于Glu-A3c可影響小麥面筋強(qiáng)度，因此初步判斷晉麥92號(hào)的強(qiáng)筋品質(zhì)性狀由Glu-A3c基因所決定。LMW-GS在Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3所編碼的亞基間存在加性效應(yīng)，在下一步的研究中需增加對(duì)晉麥92號(hào)Glu-B3位點(diǎn)等位基因的研究及分析。