虞銳鵬 王利平 趙晨凱 吳勝芳 宋啟軍

摘?要?建立了頂空-固相微萃取箭型-氣相色譜-質(zhì)譜（HS-SPME Arrow-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合多變量統(tǒng)計分析銅綠微囊藻在模擬自然環(huán)境條件下，其揮發(fā)性代謝物組成及變化規(guī)律。通過選取合適萃取頭，對不同時期銅綠微囊藻樣品中揮發(fā)性代謝物進行定性分析，鑒定了210種揮發(fā)性代謝物。采用多變量統(tǒng)計分析方法，進一步研究銅綠微囊藻生長過程中揮發(fā)性代謝物的消長變化規(guī)律，篩選出10種統(tǒng)計學(xué)顯著性差異代謝物：環(huán)己醇、二甲基三硫、苯甲醇、樟腦、2-甲氧基苯酚、3-己烯-1-醇、2，4-癸二烯醛、吲哚、檸檬醛和正壬醇。優(yōu)化了萃取溫度、萃取時間、體系鹽度等SPME Arrow萃取條件，篩選差異性代謝物的特征離子峰，并進行定量分析和方法學(xué)驗證。結(jié)果表明，10種統(tǒng)計學(xué)顯著性差異代謝物在0.050～1000 ng/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)>0.998，檢出限范圍為0.010～0.030 ng/L，回收率在76.3%～93.0%之間，RSD≤12.7%（n=6）。本方法操作簡便、快速，靈敏度高，穩(wěn)定性好，可用于藍藻水華爆發(fā)初期天然水體中揮發(fā)性代謝標(biāo)志物測定。

關(guān)鍵詞?頂空-固相微萃取箭型;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;多變量統(tǒng)計分析;銅綠微囊藻;揮發(fā)性代謝物

1?引 言

隨著湖泊流域人類活動的加劇，大量的營養(yǎng)鹽通過各種途徑進入水體，造成藻過度繁殖，并于水體表面大量聚集，形成藻類水華[1]。藻類大量死亡時，將細胞內(nèi)藻毒素及大量代謝物釋放到水中，嚴(yán)重惡化水質(zhì)，散發(fā)異味。另一方面，藻類正常生長時也會產(chǎn)生大量的揮發(fā)性有機化合物（VOCs），其作為信號物質(zhì)在水域生態(tài)系統(tǒng)中進行信息傳遞，或有利于釋放者在激烈的競爭環(huán)境中生存與繁衍[2，3]。藻類VOCs主要為醇類、醛類、酯類、萜類、硫化合物和脂肪族烴[4]。因為極低的氣味閾值和令人討厭的泥土味/霉味，水體中的2-甲基異莰醇和土臭素被廣泛檢測[5];萜類VOCs因同時具有提高藻細胞抵抗逆境脅迫的能力和化感抑制作用，有利于藻細胞在逆境脅迫中生存和繁殖，并能有效抑制其它水生生物生長[6];烷基硫化物與藻體死亡的關(guān)系[7]等一系列揮發(fā)性代謝物對環(huán)境影響的研究備受關(guān)注。如何將水華預(yù)警指標(biāo)細化，將藻類生長繁殖過程中產(chǎn)生的代謝物同傳統(tǒng)水體表征指標(biāo)相結(jié)合，建立合理評價指標(biāo)及水華預(yù)測模型，是需要研究者深入探索的方向。

固相微萃取（SPME）技術(shù)，作為水蒸汽蒸餾的替代和補充工具，用于富集揮發(fā)性有機化合物，已成為環(huán)境、食品和臨床分析中廣泛使用的萃取技術(shù)之一[8，9]。SPME具有省時、高效、不需要使用溶劑和具有一定特異性吸附等特性，但也存在機械穩(wěn)定性差、萃取頭吸附相體積小等缺點。固相微萃取箭型（SPME Arrow）作為固相微萃取領(lǐng)域的一項新技術(shù)，其頂部采用更好的保護吸附材料，易于穿刺，具有富集效率高、再現(xiàn)性好、自動化程度高等優(yōu)點。Helin等[10]采用頂空SPME Arrow測定環(huán)境空氣和廢水中揮發(fā)性低分子量烷基胺。Kremser等[11]將SPME Arrow直接浸泡在實驗室水和地下水中提取多環(huán)芳烴，方法檢出限可達50 ng/L;與傳統(tǒng)的SPME纖維頭和攪拌棒吸附萃?。⊿BSE）相比，萃取率更高。Castro等[12]將SPME Arrow應(yīng)用于魚類樣品中人工合成麝香的檢測，在這種復(fù)雜基質(zhì)中檢出限達到0.5 ng/g。

針對我國有害藍藻水華優(yōu)勢藻種中揮發(fā)性有機化合物復(fù)雜和低含量的特點，本研究采用HS-SPME Arrow GC-MS聯(lián)用技術(shù)，對不同生長時期的銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa，M. aeruginosa）樣進行分析，采用多變量統(tǒng)計分析方法，研究其揮發(fā)性代謝物的消長變化規(guī)律，篩選出10種統(tǒng)計學(xué)顯著性差異代謝物，建立了主要代謝物的高靈敏度定量分析方法，為評價水環(huán)境質(zhì)量和藻水華預(yù)警預(yù)報提供了一種可靠的監(jiān)測手段。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

LECO Pegasus BT氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀系統(tǒng)（美國LECO公司）;PAL RTC 自動進樣系統(tǒng)及孵化爐和加熱攪拌模塊（瑞士CTC Analytics AG公司）;固相微萃取頭： 120 μm divinylbenzene/carboxen/polydimethyl-?siloxane （DVB/CAR/PDMS）、120 μm DVB/PDMS、120 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS、100 μm Polyacrylate（PAL SPME Arrow，瑞士CTC Analytics AG公司）;50/30 μm DVB/CAR/PDMS （SPME，美國Supelco公司）;Milli-Q Direct 8純水儀（美國Millipore公司）;20 mL頂空瓶（德國Gerstel公司） 。

內(nèi)標(biāo)： 氘代吡啶（99.5%，德國Dr公司）;NaCl（優(yōu)級純，在450℃烘干6 h 后使用）;甲醇（色譜純，美國天地公司）;其它化學(xué)品 （純度≥98%）購于安譜公司。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液： 配制濃度為10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)物（環(huán)己醇、 二甲基三硫、 苯甲醇、 樟腦、 2-甲氧基苯酚、 3-己烯-1-醇、 檸檬醛、 2，4-癸二烯醛、 吲哚、 正壬醇）儲備液，用甲醇逐級稀釋成10 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。頂空標(biāo)準(zhǔn)混合溶液： 向純水中添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)物，配制成濃度分別為1、 10、 100和1000 ng/L含有10 ng/L內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。

2.2?樣品前處理方法

藻樣采集： 2018年 5月在太湖梅梁灣采集銅綠微囊藻，并經(jīng)顯微鏡觀察、鑒定。將藻水樣放入光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)： 溫度25℃，光照強度6000 Linux，光暗比12 h∶12 h，擴大培養(yǎng)7 d，到達對數(shù)生長期，取對數(shù)生長期的純藻接種。顯微鏡每日觀察藻類生長狀況。樣品每隔一日采集： 分別為A、B、C、D、E、F、G 7個實驗組（后同）。每組各取6個平行樣，迅速液氮冷凍，80℃保存。進樣前，在25℃恒溫水浴中單獨解凍10 min，恢復(fù)到室溫[13]。質(zhì)量控制（QC） 樣品制備： 將所有樣品取等體積混勻后，按照上述方法進行相同處理，得到QC樣品。

水樣采集及處理： 于水體表面0.5 m下采集，藻密度： 1.0×106～8.0×106/L，過0.45 μm 濾膜后，于20℃保存。

2.3?固相微萃取方法

在頂空瓶內(nèi)加入8 mL藻水樣。進樣模式： SPME Arrow;萃取溫度30℃;萃取時間30 min;解析時間3 min;解析溫度250℃;老化時間3 min。

2.4?GC-MS分析條件

安捷倫7890B氣相色譜條件：DB-5 MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。程序升溫：初始溫度40℃，保持2 min;以10℃/min升至250℃，保持6 min。傳輸線溫度： 280℃;離子源溫度： 210℃;質(zhì)量掃描范圍： 33～400 amu;載氣He（99.999%），恒流模式，流速： 1.0 mL/min;不分流進樣。隨機安排樣本進行順序，每隔8個樣品加入1個QC樣品檢測。

2.5?數(shù)據(jù)處理

化合物定性分析： 經(jīng)LECO軟件自動解卷積處理總離子流圖。經(jīng)NIST2014和Wiley9譜庫相匹配，要求正反匹配度均大于800（最大值為1000）。在相同色譜條件下，利用正構(gòu)烷烴（C6～C26） 計算保留指數(shù)，同譜庫標(biāo)準(zhǔn)值檢索對比。采用峰面積歸一化法計算化合物的相對含量。

差異性代謝物定量分析： 利用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對篩選得到的差異代謝物進行定量分析。

2.6?多元統(tǒng)計分析

采用 SIMCA-P 15.0、Metabo Analyst 4.0對數(shù)據(jù)集進行主成分分析（Principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（Partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）、層次聚類和變量排序等多元分析，并使用置換策略進行了模型評估。

3?結(jié)果與討論

3.1?差異代謝物的篩選

3.1.1纖維涂層選擇?選用不同萃取纖維涂層分別萃取銅綠微囊藻樣品（不同時期藻樣等量混勻）3次。考察了5種SPME Arrow萃取頭對銅綠微囊藻揮發(fā)性有機物的影響（圖1中A～E），以出峰個數(shù)和總峰面積作為萃取能力的主要考察指標(biāo)。結(jié)果表明，選擇DVB/CAR/PDMS萃取頭時目標(biāo)物萃取效率最高，出峰數(shù)量最大，總峰面積是其它4種萃取頭的1.62～8.50倍。DVB/CAR/PDMS外層是PDMS/DVB，內(nèi)層是CAR/PDMS，具有分子篩選能力。小分子先通過DVB涂層，吸附于內(nèi)層CAR上，而大分子則被吸附于外層DVB表面[14]，能兼顧各類化合物，對復(fù)雜天然揮發(fā)性有機化合物有更大的優(yōu)勢。其它4種涂層對分子的大小、極性強弱各有偏重，不適于本研究中種類復(fù)雜、變化差異大的藻類代謝物。后續(xù)實驗均采用DVB/CAR/PDMS。

萃取相同銅綠微囊藻樣品，SPME Arrow是普通SPME（兩者均為DVB/CAR/PDMS） 的1.32和1.80倍（圖中1A和F）。SPME Arrow吸附相具有更大的表面積和體積，靈敏度更高，適合痕量有機物的富集。

3.1.2?穩(wěn)定性評估?為了考察分析方法的穩(wěn)定性，待色譜條件穩(wěn)定后，在GC-MS分析序列中每隔8個樣本加入1個QC樣品。對QC樣品進行PCA分析（圖2），所有QC樣品均在2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）范圍內(nèi)，說明本方法重復(fù)性好，能夠滿足代謝組學(xué)的分析要求。

實驗過程中確保實驗條件一致，包括藻的培養(yǎng)、留取樣品、低溫保存、快速解凍、SPME Arrow吸附濃縮、GC/MS進樣及分離檢測。結(jié)果表明，GC-MS總離子流圖中95%以上的共有峰峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于15%，說明本分析方法可靠、穩(wěn)定，能確保不同樣本之間的差別不是由分析方法的誤差產(chǎn)生，而是主要來自樣本本身的差異。

化合物定性處理后，共鑒定出210種代謝物，用于進一步的多元統(tǒng)計分析，其中包括醇類28種、醛類23種、酮類27種、酯類24種、萜烯類19種、脂肪族烴36種、硫化物11種、芳香族化合物16種。在生長中期檢測到己醛和己醇，通常認為此類C6綠色揮發(fā)物（C6 green leaf volatiles）僅在高等植物受損傷時釋放[15]。

3.1.3?PCA模型和PLS-DA模型?PCA作為非監(jiān)督統(tǒng)計方法，用于查看樣本之間的分布趨勢。對HS-SPME Arrow-GC-MS 采集得到的不同生長時期銅綠微囊藻數(shù)據(jù)進行PCA，圖 3為PCA模型的可視化得分圖。由PCA結(jié)果可知，A、B與C組離得更近，D、E、F和G組離得更近，代謝輪廓存在重疊，后4組明顯偏離前3組，表明銅綠微囊藻在第四生長時期時生長代謝出現(xiàn)明顯變化。然而，第一和第二主成分只貢獻了總變異的 32.3%，主要是所選擇的7個不同生長周期的銅綠微囊藻產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物種類變異復(fù)雜。因此，不能僅用簡單降維處理的樣品代替整個樣品，需更多的分析以佐證銅綠微囊藻揮發(fā)性成分的變化規(guī)律。

PLS-DA作為有監(jiān)督的方法，用于多類分類判別分析時性能穩(wěn)健，可以減少變量間多重共線性產(chǎn)生的影響。圖4顯示PLS-DA模型變量投影重要度（Variable importance projection，VIP）值大于1.5，并結(jié)合t檢驗的p值（閾值≤0.05）獲得差異性化合物30種，R2=0.983，Q2=0.936，用R2和Q2交叉驗證評價，說明此擬合質(zhì)量佳，可用于輔助標(biāo)志代謝物的篩選。

3.1.4?熱圖分析?使用熱圖對7個實驗組之間的相關(guān)性進行了分析。圖 5展示的是前30個皮爾遜分層聚類 p<0.05的代謝物，p值的計算使用單因素方差分析（One-way ANOVA）。紅色表示較高的強度，黑色表示中等強度，綠色表示較低強度。在不同生長階段，各類揮發(fā)性成分的釋放規(guī)律不同;2，4-癸二烯醛、檸檬醛和2-甲氧基苯酚在初期達到最大值，隨著生長呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢;3-己烯-1-醇和2，4-二噻戊烷濃度由低到高，又逐漸降低;而二甲基三硫、丙酮、苯甲醇、3-甲基吲哚和辛醛的濃度則持續(xù)穩(wěn)步升高。聚類熱圖分析顯示，實驗組A、B、C接近，而實驗組D、E、F、G更為接近，同PCA結(jié)論一致。

對于多組分析，于Anova前50種化合物 （f>10，p<0.01），結(jié)合PLS-DA統(tǒng)計結(jié)果，從其中篩選出10種統(tǒng)計學(xué)顯著性差異代謝物： 環(huán)己醇、二甲基三硫、苯甲醇、樟腦、2-甲氧基苯酚、3-己烯-1-醇、2，4-癸二烯醛、吲哚、檸檬醛和正壬醇，加以關(guān)注。

3.2?差異代謝物的定量分析

SPME Arrow相比以往的SPME具有更大的表面積和靈敏度，樣品通量提高2倍以上，萃取速度更快。 為使其快速、高效富集目標(biāo)物，并確保萃取穩(wěn)定性，需對萃取條件進行優(yōu)化[16]。

3.2.1?空白實驗

針對銅綠微囊藻揮發(fā)性代謝物分析中樣品前處理、測定等環(huán)節(jié)可能受到的污染，干凈頂空瓶需保持在120℃烘干1 h。SPME Arrow進樣后，保持250℃下解析3 min使樣品完全進入儀器。為盡量減少殘留，可適當(dāng)提高溫度，繼續(xù)老化3 min。以純水作為空白，進行HS-SPME Arrow-GC-MS進樣分析。結(jié)果表明，10種差異代謝物均未檢出，滿足分析要求。

3.2.2?萃取溫度?提高萃取溫度可以減少達到平衡所需的時間。然而溫度對萃取具有動力學(xué)和熱力學(xué)雙重影響： 溫度升高，分析物擴散速度加快，有利于縮短衡時間[17];另一方面，升溫使分析物在涂層和樣品中的分配系數(shù)減小，靈敏度降低。考察了3種溫度（25℃、30℃和35℃）的影響。由圖6可見，隨著溫度從25℃增加到30℃，萃取效率明顯增加，而繼續(xù)增加到35℃，萃取效率升高幅度不大，樟腦和2，4-癸二烯醛略有降低。 特別是濃度最高的二甲基三硫，隨溫度升高，萃取效率持續(xù)降低。這主要是因其極易揮發(fā)，溫度升高會導(dǎo)致其在涂層的分配系數(shù)降低。另一方面，為了避免溫度高于35℃時分析物發(fā)生分解和相互轉(zhuǎn)化的可能性，選擇萃取溫度為30℃（注： 二甲基三硫、2-甲氧基苯酚、2，4-癸二烯醛和吲哚實際量為圖中所示10倍，下同）。

3.2.3?萃取時間和鹽分的影響?SPME Arrow基于待測物在涂層和樣品基質(zhì)間分配平衡。理想情況下，應(yīng)在選擇提取時間內(nèi)使所有分析物達到平衡。

然而，沸點較高、非極性和弱極性的分析物，平衡時間較長，而且樣品中共存組分存在競爭吸附，故可選取在非平衡態(tài)下較短的時間內(nèi)萃取。萃取時間對萃取效率影響如圖7所示，30 min后，萃取效率不再明顯提高。本研究選擇萃取時間為30 min，以期達到萃取效率和萃取時間的最佳結(jié)合。

除萃取時間、溫度必須嚴(yán)格控制，確保良好的精密度外，體系鹽度也是影響SPME Arrow萃取效率的因素。鹽析作用可降低疏水物質(zhì)在水中的溶解度，增加其在頂空中的含量，提高靈敏度。但鹽度過大，可能會增加溶液的粘稠度，延長達到平衡的時間[18]?？疾炝他}度對SPME Arrow 萃取效率的影響。平行量取 8 mL 水樣，分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 g NaCl，發(fā)現(xiàn)在加入2.0 g NaCl時萃取量最大，但總萃取量僅增長小于15%，說明鹽析效應(yīng)對這10種化合物萃取效率不顯著。本實驗選擇不添加NaCl。

3.3?線性范圍、檢出限和精密度

配制濃度分別為1、10、100、1000 ng/L的系列頂空標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，在上述優(yōu)化條件下進行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各目標(biāo)化合物在0.050～1000 ng/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。檢出限（LOD）以3倍信噪比（S/N） 計算，采用本方法對濃度為 100 ng/L 的混標(biāo)樣品進行 6次平行測試，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7.1%，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12.7%。本方法的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表1。

3.4?實際樣品分析

采用本方法對太湖梅梁灣表層水源水進行測定。2019年4月水樣中銅綠微囊藻密度為1.0×106/L，各化合物濃度如表2所示，加標(biāo)回收率在 76.3%～93.0%之間，表明基質(zhì)對本方法的影響較小，本方法可用于實際水樣的測定。6周后，在同一水域采樣，藻密度為8.0×106/L，3-己烯-1-醇、環(huán)己醇、正壬醇、二甲基三硫、吲哚濃度明顯增高，提高了15～230倍。此時水體尚未達到輕度水華。后續(xù)研究中，可以采用本方法監(jiān)測藻類代謝物的組成及濃度變化，為建立藻類水華預(yù)測模型提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

4?結(jié) 論

建立了頂空-固相微萃取箭型-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，測定不同時期銅綠微囊藻中揮發(fā)性代謝物。結(jié)合多變量統(tǒng)計分析方法，篩選出10種統(tǒng)計學(xué)顯著性差異代謝物并定量分析，此方法簡便、快捷、可自動化運行，結(jié)果準(zhǔn)確，為研究藻類代謝物的變化規(guī)律和藻類水華預(yù)警預(yù)報提供了可靠的監(jiān)測手段。

References

1?Dokulil M T，Teubner K. Hydrobiologia，2000，438： 1-12

2?Zuo Z J，Zhu Y R，Bai Y L，Wang Y. Plant Physiol. Biochem.，2012，51（2）： 175-184

3?ZUO Zhao-Jiang. Acta Hydrobiologica Sinica，2017，41（6）： 1369-1378

左照江. 水生生物學(xué)報，2017，41（6）： 1369-1378

4?Walsh K，Jones G J，Dunstan R H. Phytochemistry，1998，49（5）： 1227-1239

5?DUAN Lian，DENG Jia-Hui，LIU Li-Peng，CHEN Meng-Ting，MA Qiao. Chinese J. Anal. Chem.，?2019，47（4）： 527-532

段 煉，鄧嘉輝，劉立鵬，陳夢婷，馬 喬. 分析化學(xué)，2019，47（4）： 527-532

6?Loreto F，Schnitzler J P. Trends Plant Sci.，2009，15（3）： 154-166

7?Guo L. Science，2007，317（5842）： 1166

8?ZHAN Nan，ZHU Shuai，GUO Feng，TIAN Qin，RAO Zhu. Chinese J. Anal. Chem.，2018，46（12）： 2004-2010

戰(zhàn) 楠，朱 帥，郭 峰，田 芹，饒 竹. 分析化學(xué)，2018，46（12）： 2004-2010

9?LONG Li-Mei，SONG Sha-Sha，CAO Xue-Li. Chinese Journal of Chromatography，2019，37（3）： 89-94

龍立梅，宋沙沙，曹學(xué)麗. 色譜，2019，37（3）： 89-94

10?Helin A，Rnkk T，Parshintsev J，Hartonen K，Schilling B，Lubli T，Riekkola M L. J Chromatogr. A，2015，1426： 56-63

11?Kremser A，Jochmann M A，Schmidt T C. Anal. Bioanal. Chem.，2016，408（3）： 943-952

12?Castro O，Trabalón L，Schilling B，Borrull F，Pocurull E. J. Chromatogr. A，2019，1591（26）： 55-61

13?Chen J. Anal. Chem.，?2017，89： 8366-8371

14?WU Cai-Ying. Solid Phase Micro Extraction. Beijing： Chemical Industry Press，2012：?85-107

吳采櫻. 固相微萃取，北京： 化學(xué)工業(yè)出版社，2012：?85-107

15?Fall R，Karl T，Hansel A，Jordan A. J. Geophys. Res.，?1999，104（D13）： 15963-15974

16?LIU Qian，LIAN Hui-Yong，YU Chong-Tian. Environmental Chemistry，?2017，36（11）： 2515-2517

劉 茜，練慧勇，余翀?zhí)? 環(huán)境化學(xué)，2017，36（11）： 2515-2517

17?Godayol A，Alonso M，Besalu E，Sanchez J M，Antico E. J. Chromatogr. A，2011，1218（30）： 4863-4868

18?Castells P，Santos F J，Galceran M T. J. Chromatogr. A，2003，984（1）： 1-8