李雙 洪夢(mèng)蓉 王春芳 陳樹(shù)兵 徐繼林 陳娟娟

摘 要 采用13C 穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)結(jié)合高分辨質(zhì)譜方法，研究了小硅藻中4類光合膜脂（二酰甘油單半乳糖脂（MGDG）、二酰甘油雙半乳糖脂（DGDG）、二酰甘油硫代糖脂（SQDG）和磷脂酰甘油（PG））的合成途徑。與通過(guò)物質(zhì)含量的變化進(jìn)行合成與代謝途徑研究的傳統(tǒng)方法相比，本方法更直觀、準(zhǔn)確地闡明了小硅藻光合膜脂中碳原子的去向。研究結(jié)果表明，小硅藻中4類光合膜脂均被標(biāo)記，且標(biāo)記含量在小硅藻生長(zhǎng)周期的整個(gè)平臺(tái)期逐漸增加。對(duì)二級(jí)質(zhì)譜碎裂片段分析結(jié)果表明，光合膜脂的空間結(jié)構(gòu)在13C標(biāo)記方面起著決定性作用，即4類光合膜脂的極性頭部被優(yōu)先標(biāo)記，其次是甘油骨架，最后是兩條脂肪酸酰基鏈，且兩條脂酰鏈的位置差別影響不大，幾乎是同步合成。本方法可以直觀準(zhǔn)確地闡明小硅藻中光合膜脂對(duì)碳原子的利用途徑，為相關(guān)研究提供了參考。

關(guān)鍵詞 13C穩(wěn)定同位素示蹤;小硅藻;光合膜脂;四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜

1 引 言

海洋微藻作為灘涂貝類的主要餌料，其脂類組成直接影響灘涂貝類的脂類合成，進(jìn)而影響貝類的口感和風(fēng)味。光合膜脂作為微藻體內(nèi)的主要極性脂類，對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、能量?jī)?chǔ)存、物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)化均起重要作用[1～3]。光合膜脂包括極性頭部、甘油骨架和脂?；?，根據(jù)極性頭部差異分為二酰甘油單半乳糖脂（MGDG）、二酰甘油雙半乳糖脂（DGDG）、二酰甘油硫代糖脂（SQDG）和磷脂酰甘油（PG）。針對(duì)海洋微藻光合膜脂合成途徑的常規(guī)研究方法，主要通過(guò)測(cè)定不同生長(zhǎng)階段脂質(zhì)含量變化實(shí)現(xiàn)，研究對(duì)象包括脂肪酸、甾醇等。研究表明，絕大多數(shù)脂肪酸不以游離態(tài)存在于生物體內(nèi)，而是以脂肪?；男问酱嬖谟诟鞣N甘油糖脂、甘油磷脂、鞘脂、三酰甘油等脂類分子中，這些分子是生物體內(nèi)最直接的活性單元結(jié)構(gòu)[4～8]。

同位素示蹤被認(rèn)為是研究代謝途徑最明晰的技術(shù)手段，與放射性同位素相比，13C、2H、18O 等穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)更靈敏、穩(wěn)定，可長(zhǎng)時(shí)間示蹤，且不會(huì)造成放射性輻射損傷，已廣泛用于食物營(yíng)養(yǎng)關(guān)系的研究[9～12]。同位素比例質(zhì)譜技術(shù)針對(duì)生物體內(nèi)全部脂質(zhì)同位素標(biāo)記情況進(jìn)行示蹤，但無(wú)法對(duì)標(biāo)記后的特定脂質(zhì)進(jìn)行分析。研究表明，穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)結(jié)合高分辨質(zhì)譜分析手技術(shù)可以直接示蹤食物或藥物中脂質(zhì)的代謝，包括甾脂、磷脂、三酰甘油、鞘脂以及酰基輔酶A等[13～15]，并可通過(guò)多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)，獲得同位素標(biāo)記的具體位置。目前，利用同位素示蹤技術(shù)探究海洋微藻中光合膜脂合成途徑的研究比較少。宗春光等[16]利用13C穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)探究小硅藻在整個(gè)生長(zhǎng)周期被標(biāo)記總脂在含量方面的變化，但未指出脂質(zhì)的具體標(biāo)記位置[16，17]。

本研究將13C穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)和高分辨質(zhì)譜技術(shù)用于海洋微藻光合膜脂合成途徑研究中，以13C標(biāo)記的小硅藻為研究對(duì)象，在分辨率70000條件下，直接采集目標(biāo)化合物的高準(zhǔn)確度質(zhì)量數(shù)（分辨率>70000，m/z 200），在精確到實(shí)際脂類分子結(jié)構(gòu)和組成的水平上，闡明小硅藻中光合膜脂的合成途徑，為研究脂類代謝途徑，以及探究貝類對(duì)餌料微藻特征脂類同化規(guī)律提供了新思路。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Q-Exactive四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（配H-ESI II源）、UltiMate3000高壓液相色譜（配自動(dòng)進(jìn)樣器）、Thermo Hypersil Gold C18（色譜柱100 mm ×2.1 mm，1.9 μm，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;Milli-Q超純水制備儀（美國(guó)Millipore 公司）;冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Labconco公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA公司）。

二酰甘油單半乳糖脂（MGDG）、二酰甘油雙半乳糖脂（DGDG）、二酰甘油硫代糖脂（SQDG）和磷脂酰甘油（PG）標(biāo)準(zhǔn)品（≥99%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）;甲酸（色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）。其它均為色譜純?cè)噭ǖ聡?guó)Merck公司）。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水（18.2 MΩ cm）。NaH13CO3中13C/12C比值為99%（美國(guó)Sigma公司）。

2.2 小硅藻光合膜脂類13C同位素標(biāo)記

小硅藻（Nitzschiaclosterium f. minutissima）由寧波大學(xué)海洋生物實(shí)驗(yàn)室藻種室提供。培養(yǎng)海水（pH 8.30，鹽度28‰）在使用前經(jīng)過(guò)0.45 μm醋酸纖維濾膜過(guò)濾后，煮沸，冷卻，培養(yǎng)液采用f/2 配方[16]： 75 mg/L NaNO3，5 mg/L NaH2PO4，20 mg/L Na2SiO3，3.15 mg/L FeCl3·6H2O，4.36 mg/L EDTA-Na2，10 mg/L CuSO4·5H2O，22 mg/L ZnSO4·7H2O，10 mg/L CoCl2·6H2O，18 mg/L MnCl2·4H2O，6.3 mg/L NaMoO4·2H2O，1 mg/L VB12，1 mg/L Biotin 和 200 mg/L Vitamin B1。將培養(yǎng)液置于2500 mL的錐形瓶中，光強(qiáng)3000～4000 lux，（20±2）℃，每天搖晃3次，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。將收集的藻液以4500 r/min離心5 min，收集下層藻泥，冷凍干燥后，于80℃保存，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

小硅藻單種培養(yǎng)至平臺(tái)初期，搖勻后各取600 mL均分至18個(gè)錐形瓶，分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組9瓶。實(shí)驗(yàn)組各添加0.6 g NaH13CO3，對(duì)照組各添加0.6 g NaHCO3，同時(shí)充氮?dú)?30 min后密封，以排除剩余CO2干擾。之后每?jī)商焯砑覰aH13CO3（實(shí)驗(yàn)組）和 NaHCO3（對(duì)照組）各0.1 g，添加前充氮?dú)?，以確保NaHCO3或NaH13CO3作為微藻生長(zhǎng)的唯一碳源。連續(xù)培養(yǎng)10天，在第4、7和10天分別收集兩組樣品，冷凍干燥后，于80℃保存。

2.3 總脂提取

稱取藻粉50 mg，采用改進(jìn)后的 Bligh-Dyer 法提取總脂[18]。取50 mL提取液（三氯甲烷-甲醇-水，1∶2∶0.8，V/V），振蕩5 min，超聲15 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，靜置30 min，取下層溶液，氮?dú)獯抵两?，用甲醇定容?.0 mL，過(guò)0.22 μm濾膜，待分析。

2.4 儀器條件

HPLC色譜條件： Hypersile Gold C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，5 μm），柱溫40℃，進(jìn)樣量： 10 μL。流動(dòng)相A為乙腈-異丙醇（3∶1，V/V）溶液，流動(dòng)相B為水-乙腈（1∶2，V/V）溶液，均加入5 mmol/L醋酸鋰;流速 0.3 mL/min;梯度洗脫： 0～15 min，0%～50% A;15～17 min，50%～100% A;17～19 min，100% A;19～19.1 min，100%～0% A;19.1～23 min，0% A。

質(zhì)譜條件： 采用正/負(fù)離子掃描，質(zhì)量范圍m/z 100～1000，分辨率70000 （m/z 200），自動(dòng)增益控制（AGC）目標(biāo)值5×105。測(cè)定SQDG和PG時(shí)，采用負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓值2700 V;測(cè)定MGDG和DGDG時(shí)，采用正離子模式，毛細(xì)管電壓值3500 V。離子傳輸管溫度300℃;鞘氣（N2）流速： 35 L/h;輔助氣（N2）流速： 10 L/h;氣化室溫度350℃，儀器運(yùn)行前進(jìn)行校正。二級(jí)質(zhì)譜，分辨率35000;自動(dòng)增益控制（AGC）目標(biāo)值2×105;碰撞能量范圍25%～40%; 保留時(shí)間采集范圍： 根據(jù)一級(jí)色譜圖中各個(gè)目標(biāo)物質(zhì)的保留時(shí)間值±1.0 min。

2.5 光合膜脂13C同位素的定性和定量分析

13C同位素標(biāo)記后化合物分子結(jié)構(gòu)不受影響，同源化合物會(huì)呈現(xiàn)共流出現(xiàn)象，色譜保留時(shí)間完全一致，通過(guò)對(duì)比保留時(shí)間可初步確定化合物的存在形式，并參考文獻(xiàn)[19～23]，對(duì)二級(jí)質(zhì)譜掃描產(chǎn)生的特征離子碎片進(jìn)行解析（誤差值<5×10?6），綜合判斷，進(jìn)行定性分析;通過(guò)提取每類光合膜脂的特征離子碎片，并對(duì)13C同位素標(biāo)記后峰面積疊加，進(jìn)行13C同位素的定量分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 小硅藻的培養(yǎng)

采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)量藻種密度并繪制生長(zhǎng)曲線，由圖1可知，小硅藻培養(yǎng)的0～9天屬于對(duì)數(shù)期，10～20天為平臺(tái)期，從21天開(kāi)始進(jìn)入衰敗期。研究表明，小硅藻體內(nèi)脂類化合物在平臺(tái)期大量合成并積累，因此選擇處于平臺(tái)初期的小硅藻進(jìn)行標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。藻種培養(yǎng)至平臺(tái)初期后，分別取600 mL均分至18個(gè)錐形瓶，劃分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，按照2.2節(jié)方法，進(jìn)行小硅藻光合膜脂類13C同位素標(biāo)記。

3.2 提取液的選擇

光合膜脂是總脂類化合物的主要組成部分，根據(jù)待測(cè)化合物的性質(zhì)，采用Blight-Dyer法[18]，即采用三氯甲烷-甲醇-水 （1∶2∶0.8，V/V） 對(duì)小硅藻中總脂進(jìn)行提取，3種溶劑的極性范圍覆蓋廣，完全滿足脂類化合物的提取要求。

3.3 儀器條件的優(yōu)化

通過(guò)直接進(jìn)樣的方式對(duì)單標(biāo)進(jìn)行質(zhì)譜分析，比較正/負(fù)離子模式下的響應(yīng)強(qiáng)度，確定每類化合物的最佳電離方式。結(jié)果表明，MGDG和DGDG在正離子模式下響應(yīng)強(qiáng)度明顯優(yōu)于負(fù)離子模式，且形成的碎裂片段也更為豐富，而含電負(fù)性集團(tuán)的SQDG和PG更易形成[M-H]峰。

光合膜脂作為低極性化合物，很難通過(guò)弱酸或弱酸鹽促進(jìn)離子化，產(chǎn)生高豐度[M+H]+。因此，流動(dòng)相中加入強(qiáng)離子化試劑醋酸鋰，并考察了不同添加量（2、5和10 mmol/L）的影響。結(jié)果表明，流動(dòng)相中含有5和10 mmol/L醋酸鋰時(shí)，目標(biāo)化合物離子響應(yīng)值達(dá)到最大，因此，選擇在流動(dòng)相中添加5 mmol/L醋酸鋰作為助離子化試劑。此外，考察了乙腈-異丙醇的體積比（5∶1、3∶1、1∶1）對(duì)色譜峰形的影響，結(jié)果表明，乙腈-異丙醇（3∶1，V/V）作為流動(dòng)相A時(shí)獲得了最優(yōu)的色譜峰形、分離效果和保留時(shí)間。

3.4 13C同位素定性分析

MGDG和DGDG在ESI+模式下，形成的分子離子峰包括[M+Li]+和[M+Na]+，以[M+Li]+作為基峰，并對(duì)13C同位素標(biāo)記后的[M+Li]+進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，推測(cè)13C的具體標(biāo)記位置。MGDG的[M+Li]+二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生特征碎片離子m/z 227.11 [C9H16O6Li]+，是極性頭部單半乳糖CO鍵斷裂，經(jīng)過(guò)重排反應(yīng)得到一個(gè)Li+后形成的;DGDG的[M+Li]+二級(jí)質(zhì)譜掃描，產(chǎn)生特征碎片離子m/z 405.14[C15H26O11Li]+，是極性頭部雙半乳糖CO鍵斷裂，經(jīng)過(guò)重排反應(yīng)得到一個(gè)Li+后形成的;負(fù)離子掃描模式下，SQDG的極性頭部可產(chǎn)生m/z 225.03 [C6H9O7S]的特征碎片離子;PG可產(chǎn)生m/z 227.03 [C6H12O7P]、m/z 171.01 [C3H8O6P]和m/z 153.00 [C3H6O5P]特征碎片離子。根據(jù)中性丟失?；満螽a(chǎn)生的碎裂片段可用于確定?；M成及位置分布[19～23]。R

以MGDG-（20∶5～16∶2）為例，分別提取對(duì)照組（圖2A）和實(shí)驗(yàn)組（圖2B和圖2C）m/z 779.5269（保留時(shí)間（RT） 9.30 min）進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜圖差異性分析。與圖2A相比，圖2B在m/z 779.5269 [M+Li]+和m/z 795.5012 [M+Na]+的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)了兩簇新的質(zhì)譜峰，分別為m/z 785.5474和802.6144;在圖2B基礎(chǔ)上，圖2C增加一簇新的質(zhì)譜峰m/z 819.6035。將13C同位素標(biāo)記后新出現(xiàn)的化合物m/z 785.5474、 802.6144和819.6035分別提取，并將得到的提取離子色譜圖同原化合物m/z 779.5269進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)此類化合物呈現(xiàn)共流出現(xiàn)象，色譜保留時(shí)間完全一致（RT 9.30 min），可初步確定是同種化合物的不同標(biāo)記形式（圖3）。

通過(guò)對(duì)上述化合物，包括對(duì)照組的m/z 779.5269和13C同位素標(biāo)記后的m/z 785.5474、802.6144、819.6035進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，對(duì)產(chǎn)生的碎裂片段進(jìn)行質(zhì)譜解析，進(jìn)一步確定13C同位素的具體標(biāo)記位置（圖4）。由圖4A可知，m/z 779.5269在碰撞能下產(chǎn)生的主要碎裂片段離子有3個(gè)： m/z 227.1063 [C9H16O6Li]+是極性頭部單半乳糖CO鍵斷裂，經(jīng)過(guò)重排反應(yīng)得到Li+后形成的，可作為MGDG特征片段離子;m/z 475.3151 [M+Li-R2COOH]+和m/z 529.3255 [M+Li-R1COOH]+，是?；溤谀鸽x子基礎(chǔ)上發(fā)生中性丟失后形成的，酰基鏈分別為FA 20∶5和FA 16∶2，通過(guò)比較豐度值，可最終確定此化合物為MGDG-（20∶5～16∶2）。

13C同位素標(biāo)記后的m/z 785.5474較對(duì)照組m/z 779.5269分子量增加6 Da，說(shuō)明MGDG-（20∶5～16∶2）中有6個(gè)C被優(yōu)先標(biāo)記。由圖4B可知，m/z 785.5474產(chǎn)生的主要碎裂片段離子有3個(gè)： 極性頭部m/z 227.1063 [C9H16O6Li]+轉(zhuǎn)變?yōu)閙/z 233.1299 [13C6C3H16O6Li]+（Δ=6 Da），表明極性頭部基團(tuán)含有的6個(gè)C被標(biāo)記;中性丟失?；満蟮膬蓚€(gè)碎裂片段m/z 481.3142和535.3447，較對(duì)照組m/z 475.3151和m/z 529.3255分子量均增加6 Da，表明13C同位素標(biāo)記第4天時(shí)，極性頭部單半乳糖基團(tuán)含有的6個(gè)C被優(yōu)先標(biāo)記，而兩條?；溇幢粯?biāo)記。

13C同位素標(biāo)記后的m/z 802.6144較對(duì)照組m/z 779.5269分子量增加23 Da，表明化合物MGDG-（20∶5～16∶2）有23個(gè)C被標(biāo)記。由圖4C可知，m/z 802.6144在碰撞能下產(chǎn)生的主要碎裂片段離子有3個(gè)： 極性頭部m/z 227.1063 [C9H16O6Li]+轉(zhuǎn)變?yōu)閙/z 236.1402 [13C9H16O6Li]+（Δ=9 Da），表明極性頭部含有的9個(gè)C均被標(biāo)記;中性丟失?；満蟮膬蓚€(gè)碎裂片段： [M+Li-R2COOH]+由m/z 475.3151轉(zhuǎn)變?yōu)閙/z 481.3072（Δ=6 Da），表明sn-2酰基鏈有23-6=17個(gè)13C原子被標(biāo)記，[M+Li-R1COOH]+由m/z 529.3255轉(zhuǎn)變?yōu)閙/z 552.3492（Δ=23 Da），表明sn-1?；溣?3-23=0 13C被標(biāo)記，即sn-1?；溛幢粯?biāo)記。通過(guò)m/z 785.5474進(jìn)一步驗(yàn)證，m/z 802.6144較13C同位素標(biāo)記的m/z 785.5474分子量增加了17 Da，表明13C同位素標(biāo)記第10天時(shí)，該化合物在極性頭部單半乳糖6個(gè)13C被優(yōu)先標(biāo)記外，又有17個(gè)13C被標(biāo)記，分別為極性頭部甘油骨架的3個(gè)13C，sn-2?；?4個(gè)13C和sn-1酰基未被標(biāo)記。

13C同位素標(biāo)記后的m/z 819.6035比m/z 779.5269分子量增加40 Da，表明化合物MGDG-（20∶5～16∶2）有40個(gè)13C被標(biāo)記。由圖4D可知，m/z 819.6035在碰撞能下產(chǎn)生的主要碎裂片段離子有3個(gè)： 極性頭部m/z 236.1400 [13C9H16O6Li]+含有的9個(gè)C均被標(biāo)記;進(jìn)一步分析中性丟失?；満蟮乃榱哑?，[M+Li-R2COOH]+由m/z 475.3151轉(zhuǎn)變?yōu)閙/z 499.3636（Δ=24 Da），表明sn-2?；溣?0-24=16個(gè)13C原子被標(biāo)記;另一個(gè)丟失?；満蟮乃榱哑蝃M+Li-R1COOH]+由m/z 529.3255轉(zhuǎn)變?yōu)閙/z 554.4081（Δ=25 Da），表明sn-1酰基鏈有40-25=15個(gè)13C原子被標(biāo)記。通過(guò)m/z 802.6144進(jìn)一步驗(yàn)證，m/z 819.6035化合物較13C同位素標(biāo)記的m/z 802.6144分子量增加了17，表明13C同位素標(biāo)記第10天時(shí)，該化合物在極性頭部9個(gè)13C及sn-2號(hào)?；?4個(gè)13C被標(biāo)記外，又有17個(gè)13C被標(biāo)記，分別為sn-2?；黾拥?個(gè)13C和sn-1酰基的15個(gè)13C。

光合膜脂MGDG、DGDG、SQDG和PG結(jié)構(gòu)組成相似，均可按照上述13C同位素標(biāo)記后的MGDG定性分析方法，對(duì)產(chǎn)生的碎裂片段進(jìn)行質(zhì)譜解析，進(jìn)一步確定13C同位素的具體標(biāo)記位置。結(jié)果表明，小硅藻中4類光合膜脂均被標(biāo)記，且標(biāo)記含量在小硅藻生長(zhǎng)周期的整個(gè)平臺(tái)期逐漸增加。二級(jí)質(zhì)譜碎裂片分析結(jié)果表明，光合膜脂的空間結(jié)構(gòu)在13C標(biāo)記優(yōu)先性方面起決定性作用，即4類光合膜脂的極性頭部被優(yōu)先標(biāo)記，其次是甘油骨架，最后是兩條脂肪酸?；湥覂蓷l脂酰鏈的位置差別影響不大，幾乎是同步合成。

3.5 13C同位素定量分析

小硅藻中4類光合膜脂MGDG、DGDG、SQDG和PG均被13C同位素標(biāo)記。小硅藻平臺(tái)期13C同位素標(biāo)記含量計(jì)算有兩種方法。第一種方法是通過(guò)提取一級(jí)質(zhì)譜中13C同位素標(biāo)記后母離子精確質(zhì)量數(shù)的色譜峰面積進(jìn)行疊加定量。以MGDG-（20∶5～16∶2）為例，共含有45個(gè)C，標(biāo)記情況最多包括45種： 即m/z 779～824，覆蓋了MGDG-（20∶5～16∶2）經(jīng)13C同位素標(biāo)記后的狀態(tài)，通過(guò)提取這45個(gè)m/z值同一保留時(shí)間（9.3 min）提取離子色譜圖，并對(duì)峰面積疊加，得到MGDG-（20∶5～16∶2）13C同位素標(biāo)記后的含量值。對(duì)于MGDG類化合物13C同位素標(biāo)記后的總含量值，則需要對(duì)每種MGDG13C同位素標(biāo)記后的含量值進(jìn)行加和。小硅藻中光合膜脂酰基組成種類眾多，4類光合膜脂MGDG、DGDG、SQDG和PG經(jīng)13C同位素標(biāo)記后的含量計(jì)算非常繁瑣。

第二種方法是根據(jù)上述13C同位素標(biāo)記定性分析結(jié)果，即4種光合膜脂的極性頭部?jī)?yōu)先標(biāo)記。因此，除了對(duì)一級(jí)質(zhì)譜中13C同位素標(biāo)記后母離子精確質(zhì)量數(shù)的色譜峰面積進(jìn)行疊加定量外，還可以通過(guò)提取特征碎片離子（極性頭部）色譜圖，通過(guò)峰面積疊加進(jìn)行13C同位素標(biāo)記的定量分析。以MGDG為例，特征碎片離子為m/z 227 [C9H16O6Li]+，此碎裂片段共含有9個(gè)C，標(biāo)記情況最多有9種（m/z 228～236），完全覆蓋了所有MGDG經(jīng)13C同位素標(biāo)記后的所有狀態(tài)。通過(guò)提取這9個(gè)m/z值同一保留時(shí)間的提取離子色譜圖，并對(duì)峰面積疊加，即可對(duì)每種MGDG的13C同位素標(biāo)記情況進(jìn)行定量，而提取這9個(gè)m/z值對(duì)應(yīng)所有保留時(shí)間的提取離子色譜圖，并對(duì)峰面積疊加，即可對(duì)總的MGDG的同位素標(biāo)記情況進(jìn)行定量（圖5）。同樣，m/z 405.14 [C15H26O11Li]+作為DGDG的特征碎片離子、m/z 225.03 [C6H9O7S]作為SQDG的特征碎片離子、m/z 171.01 [C3H8O6P]和m/z 153.00 [C3H6O5P]作為PG的特征碎片離子，均可按照上述13C同位素標(biāo)記的定量方法完成。

小硅藻中4類光合膜脂均被標(biāo)記，且標(biāo)記含量在小硅藻生長(zhǎng)周期的整個(gè)平臺(tái)期逐漸增加。其中，SQDG的13C同位素標(biāo)記值在第10天達(dá)到最高（（1.20±0.08） μg/mg干粉），其次MGDG、PG和DGDG的13C同位素標(biāo)記值在第10天達(dá)到最高，依次為（0.78±0.05） μg/mg、（0.51±0.03） μg/mg和（0.39±0.03） μg/mg干粉（圖6）。

4 結(jié) 論

利用穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)結(jié)合高分辨質(zhì)譜分析手段，直接示蹤小硅藻中4種光合膜脂合成途徑，并通過(guò)多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)，獲得13C同位素標(biāo)記的具體位置，直觀準(zhǔn)確地闡明了小硅藻光合膜脂中碳原子的去向。小硅藻中4類光合膜脂均被標(biāo)記，空間結(jié)構(gòu)在13C標(biāo)記優(yōu)先性方面起決定性作用，即4類光合膜脂的極性頭部被優(yōu)先標(biāo)記，其次是甘油骨架，最后是兩條脂肪酸酰基鏈，且兩條脂酰鏈的位置差別影響不大，幾乎是同步合成，標(biāo)記含量在小硅藻生長(zhǎng)周期的整個(gè)平臺(tái)期逐漸增加。本研究為后期探究縊蟶對(duì)微藻脂類生物標(biāo)記物的同化過(guò)程提供了參考。

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