田晶晶，吳 影,2，李長(zhǎng)福，周艷林，周子呂，古紹彬,2,3,*

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023；2.河南省食品微生物工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471023；3.食品加工與安全國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，河南 洛陽(yáng) 471023）

近年來(lái)，凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）由于具有增加腸道原有益生菌數(shù)量[1]、治療腹瀉增強(qiáng)免疫[2-3]、改善腸易激綜合征[4]、降低膽固醇[5]、抑制致病菌的生長(zhǎng)[6]等益生特性，被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、保健、畜牧水產(chǎn)等[7]。該菌作為最具潛力的益生菌之一，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注[8]。目前，凝結(jié)芽孢桿菌已先后被美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局、歐洲食品與飼料菌種協(xié)會(huì)和國(guó)際乳品聯(lián)合會(huì)認(rèn)定為一般認(rèn)為安全的（generally recognized as safe，GRAS）菌種，并被列入美國(guó)農(nóng)業(yè)部和美國(guó)飼料控制委員會(huì)名單。我國(guó)于2004年批準(zhǔn)在飼料中添加，于2005年批準(zhǔn)其作為人用整腸藥物；并于2016被國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)（原國(guó)家衛(wèi)計(jì)委）列入《可用于食品的菌種名單》。作為新型益生菌，凝結(jié)芽孢桿菌常以芽孢形式添加。芽孢桿菌的芽孢是營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的休眠體，在胃酸環(huán)境中被激活萌發(fā)后具有和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞一樣的益生特性，且芽孢更具有耐酸、耐膽鹽、耐高溫等極強(qiáng)的耐受特點(diǎn)，因此工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中芽孢比營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞具有更好的工業(yè)性能[9]。有研究指出，凝結(jié)芽孢桿菌芽孢在進(jìn)入人體后4～6 h內(nèi)即可萌發(fā)形成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，并繁殖發(fā)揮益生作用，其中能夠順利通過(guò)消化系統(tǒng)的芽孢高達(dá)85%[10]。

目前，關(guān)于凝結(jié)芽孢桿菌的芽孢化途徑及調(diào)控機(jī)制鮮有報(bào)道，有關(guān)細(xì)菌芽孢形成機(jī)理的研究主要集中于枯草芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌[11]，且較明確的是芽孢桿菌芽孢化過(guò)程主要經(jīng)歷8 個(gè)階段，其中芽孢化啟動(dòng)對(duì)芽孢形成至關(guān)重要，而芽孢化啟動(dòng)調(diào)控因子Spo0A含量及磷酸化水平則是芽孢啟動(dòng)與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)Spo0A的磷酸化是由KinA、KinB、KinC、KinD、KinE 5 種組氨酸激酶調(diào)控，組氨酸激酶種類越高，所能應(yīng)答的環(huán)境刺激范圍就越廣[14]。磷酸化的Spo0A能夠直接調(diào)控與芽孢形成相關(guān)的一系列基因的表達(dá)，如參與調(diào)控母細(xì)胞中的sigma因子（σH，σF，σE，σK，σG）表達(dá)等[15-16]。

Moeller等[17]研究發(fā)現(xiàn)，并不是所有芽孢桿菌的芽孢都具有同等穩(wěn)定性，刺激形成的因素不同，芽孢的抗逆性也會(huì)存在差異。Olivier等[18]發(fā)現(xiàn)，較高溫度下形成的芽孢具有更強(qiáng)的耐熱性能；培養(yǎng)基中礦物質(zhì)離子（Ca2+、Mn2+、Mg2+）的添加也能增加形成芽孢的耐熱性能，但也降低了芽孢其他的抗逆性。芽孢桿菌在芽孢形成時(shí)，需攝入大量Ca2+，以確保生成足夠的吡啶二羧酸鈣，后者可使芽孢中的生命大分子物質(zhì)形成穩(wěn)定凝膠，從而提高其耐熱性[19]。同時(shí)，Ca2+是芽孢形成過(guò)程中相關(guān)蛋白酶及蛋白水解酶重要的輔因子[20]，因此能夠顯著促進(jìn)芽孢的形成。碳酸鈣還可穩(wěn)定發(fā)酵液pH值，防止過(guò)酸環(huán)境對(duì)芽孢形成的影響。關(guān)于碳酸鈣添加對(duì)芽孢形成及耐受性方面的研究卻鮮見相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)旨在研究凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951在碳酸鈣作用下的芽孢形成情況及抗逆性，探究碳酸鈣在凝結(jié)芽孢桿菌芽孢形成中的促進(jìn)作用，以期為工業(yè)化生產(chǎn)凝結(jié)芽孢桿菌芽孢提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951為河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物育種與代謝調(diào)控研究室分離保藏。

種子及發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖15 g，蛋白胨15 g，酵母粉10 g，硫酸鎂5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 8.0±0.05，115 ℃滅菌30 min；計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基添加2%的瓊脂，115 ℃滅菌30 min。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）：稱取8.0 g氯化鈉、0.2 g氯化鉀、0.24 g磷酸二氫鉀、1.44 g磷酸氫二鈉，溶解于800 mL蒸餾水中，2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整pH 7.4，定容至1 000 mL混勻室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

Trizol提取試劑盒、4S Red Plus核酸染色劑（BBI A606695）、瓊脂糖、第一鏈cDNA合成試劑盒 （Thermo Scientific? EP0733）、SG Fast qPCR Master Mix（High Rox） 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)賽洛捷克有限公司；PH400型臺(tái)式pH計(jì) 安萊立思儀器科技公司；DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京六一生物科技有限公司；H6-1微型電泳槽 上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠；FR980凝膠成像系統(tǒng) 上海復(fù)日科技有限公司；SMA4000微量分光光度計(jì) 美林恒通儀器有限公司；StepOne型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

將保存在-80 ℃的甘油保藏管接種到裝有30 mL種子液的250 mL三角瓶中，230 r/min、37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)16 h，然后將其接種于相同種子液中連續(xù)活化3 次備用。

1.3.2 搖瓶培養(yǎng)

將種子液以3%的接種量接到含有30 mL種子液的250 mL三角瓶中，230 r/min、37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)（68±2）h進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。

1.3.3 活菌總數(shù)及芽孢數(shù)測(cè)定

活菌總數(shù)測(cè)定：采用稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法。將樣品用0.85%無(wú)菌生理鹽水逐級(jí)稀釋到10-5、10-6、10-7倍，分別取100 μL稀釋液均勻涂布在平板上，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)48 h后觀察計(jì)數(shù)。

芽孢數(shù)測(cè)定：將樣品放入80 ℃水浴10 min[21]，然后立即將樣品置于冰水中冷卻至40 ℃左右，參照活菌計(jì)數(shù)法進(jìn)行涂布和培養(yǎng)操作，于37 ℃的恒溫培養(yǎng)4～5 d后觀察計(jì)數(shù)。

1.3.4 碳酸鈣對(duì)芽孢形成的影響

1.3.4.1 碳酸鈣添加時(shí)間、添加量及培養(yǎng)溫度對(duì)芽孢形成的影響

通過(guò)考察碳酸鈣不同添加時(shí)間（0、8、16、24、32 h），不同添加量（4%、5%、6%、7%、8%），及碳酸鈣添加情況下不同溫度培養(yǎng)（35、37、40、45、50 ℃）芽孢形成情況，研究添加碳酸鈣對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951芽孢形成的影響。

1.3.4.2 碳酸鈣對(duì)培養(yǎng)過(guò)程pH值的影響

將搖瓶培養(yǎng)至16 h，處理組添加6%的碳酸鈣，以未加碳酸鈣為對(duì)照組，每隔4 h測(cè)定培養(yǎng)基中pH值的變化，考察添加碳酸鈣對(duì)培養(yǎng)過(guò)程pH值的影響。

1.3.5 芽孢抗逆性測(cè)定[22]

在5 mL離心管中加入4 mL已有芽孢形成的培養(yǎng)液，置于80 ℃水浴10 min滅活營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，用PBS清洗3 次后加入等體積PBS，4 ℃保藏備用。芽孢存活率按下式計(jì)算：

1.3.5.1 溫度對(duì)芽孢抗性的影響

取制備好的芽孢懸浮液2 mL，分別放置于85、90、95、100 ℃水浴10 min，冷卻后采用稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法測(cè)定存活芽孢數(shù)，以未經(jīng)溫度處理的芽孢懸浮液作為對(duì)照。

1.3.5.2 pH值對(duì)芽孢抗性的影響

取制備好的芽孢懸浮液2 mL，5 000 r/min離心5 min棄上清液，分別加入2 mL pH 1.5、2.0、3.0、4.0的PBS，混勻37 ℃處理1 h和2 h后采用稀釋涂布平板法測(cè)定存活芽孢數(shù)，以pH 7.4的PBS中芽孢懸浮液作為對(duì)照。

1.3.5.3 膽鹽對(duì)芽孢抗性的影響

將制備好的芽孢懸浮液取2 mL，5 000 r/min離心5 min去上清液，分別加入2 mL膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%的PBS，37 ℃孵育2 h后采用稀釋涂布平板法測(cè)定存活芽孢數(shù)，以無(wú)膽鹽的PBS處理為空白對(duì)照組。

1.3.6 real-time PCR檢測(cè)目的基因轉(zhuǎn)錄水平

根據(jù)NCBI中凝結(jié)芽孢桿菌kinC（Gene ID：29813636）、kinE（Gene ID：29812950）、spo0A（Gene ID：29813832）和內(nèi)參基因GAPDH（Gene ID：29813473）序列，設(shè)計(jì)并合成引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 目的基因及GAPDH引物Table 1 Primers for target genes and GAPDH

參照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取總RNA。參照第一鏈cDNA合成試劑盒的使用方法，在PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA產(chǎn)物。以此為基礎(chǔ)，進(jìn)行real-time PCR，反應(yīng)體系為：20 μL的總體系中加入2×SG Fast qPCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.4 μL，超純水7.2 μL，模板cDNA 2 μL。PCR循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s，45 次循環(huán)。使用StepOne型熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

圖表采用Origin軟件進(jìn)行繪制。采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS（Version 17.0）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加碳酸鈣對(duì)芽孢形成的影響

2.1.1 碳酸鈣添加時(shí)間對(duì)芽孢形成的影響

在凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951培養(yǎng)到0、8、16、24、32 h，分別向盛有30 mL發(fā)酵液的250 mL三角瓶中添加6%的碳酸鈣，研究其對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌芽孢形成的影響。由圖1可知，碳酸鈣添加時(shí)間對(duì)芽孢形成的促進(jìn)作用差異極顯著（P＜0.01），在16 h添加碳酸鈣對(duì)芽孢形成的促進(jìn)效果最好，芽孢形成量達(dá)4.05×106CFU/mL。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該菌在12～16 h菌體生長(zhǎng)逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期（圖2），因此在該時(shí)期加入碳酸鈣既不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，又有利于促進(jìn)芽孢的形成。

圖1 碳酸鈣添加時(shí)間對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951芽孢形成的影響Fig. 1 Effect of CaCO3 addition time on sporulation of B. coagulans CGMCC 9951

圖2 凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951生長(zhǎng)曲線Fig. 2 Growth curve of B. coagulans CGMCC 9951

2.1.2 碳酸鈣添加量對(duì)芽孢形成的影響

圖3 碳酸鈣添加量對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951芽孢形成的影響Fig. 3 Effect of CaCO3 concentration on sporulation of B. coagulans CGMCC 9951

如圖3所示，未添加碳酸鈣組，在7 d后幾乎觀察不到芽孢的存在，碳酸鈣添加對(duì)芽孢形成量卻具有顯著影響，且在一定范圍內(nèi)隨著碳酸鈣添加量的增加，芽孢形成量逐漸增加，當(dāng)添加量為6%時(shí)芽孢形成量達(dá)到最大2.16×107CFU/mL，隨著碳酸鈣添加量的進(jìn)一步增加，芽孢形成量開始逐漸下降。

2.1.3 培養(yǎng)溫度對(duì)芽孢形成的影響

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951芽孢形成的影響Fig. 4 Effect of temperature on sporulation of B. coagulans CGMCC 9951

溫度是誘導(dǎo)芽孢形成的重要環(huán)境因子[23-24]。CGMCC 9951在37 ℃培養(yǎng)16 h后，將培養(yǎng)溫度分別調(diào)整到35、40、45、50 ℃，研究在有無(wú)碳酸鈣添加情況下溫度對(duì)CGMCC 9951芽孢形成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在無(wú)碳酸鈣添加情況下，不同培養(yǎng)溫度對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌芽孢的形成時(shí)間和形成量的影響差異顯著（P＜0.05）（圖4A），在40 ℃以下時(shí)，培養(yǎng)至7 d 仍無(wú)芽孢形成；而當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到為45 ℃時(shí)，培養(yǎng)3 d即可產(chǎn)生芽孢，當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，培養(yǎng)7 d，芽孢形成量最大，可達(dá)到4.56×106CFU/mL。但在相同培養(yǎng)基中添加6%碳酸鈣，培養(yǎng)至3 d時(shí)，各溫度處理均能觀察到芽孢的形成，且37 ℃處理組中芽孢數(shù)最大，可達(dá)4.53×107CFU/mL（圖4B）；隨著溫度的進(jìn)一步升高，發(fā)酵液蒸發(fā)量顯著增加，黏度激劇上升，水分活度降低，反而影響芽孢形成。

2.1.4 添加碳酸鈣對(duì)培養(yǎng)基pH值的影響

碳酸鈣可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，而pH值環(huán)境對(duì)芽孢形成及活性具有顯著影響。由圖5A可知，16 h添加6%的碳酸鈣可使培養(yǎng)基pH值從4快速上升到5.94，在18 h，pH值達(dá)到6.48時(shí)即可觀察到芽孢形成，20 h后培養(yǎng)基pH值開始繼續(xù)緩慢上升。而對(duì)照組培養(yǎng)至172 h，pH值才達(dá)到芽孢化啟動(dòng)中性偏堿環(huán)境。碳酸鈣添加組，在70 h培養(yǎng)結(jié)束后pH值逐漸升高至8.18，鏡檢觀察芽孢形成達(dá)到最大時(shí)，稀釋涂布芽孢數(shù)為4.53×107CFU/mL。而無(wú)碳酸鈣添加組在220 h時(shí)pH值為8.53（圖5B），此時(shí)芽孢達(dá)到最大1.89×107CFU/mL。本研究結(jié)果顯示碳酸鈣加入能快速改善環(huán)境pH值條件，有效縮短芽孢形成時(shí)間，增加芽孢形成量。

圖5 碳酸鈣添加對(duì)培養(yǎng)基pH值的影響Fig. 5 Effect of CaCO3 concentration on pH of medium

2.2 添加碳酸鈣對(duì)芽孢抗逆性的影響

理想的益生菌須具備較強(qiáng)抗逆性和繁殖能力，以抵抗嚴(yán)酷的生產(chǎn)加工過(guò)程以及動(dòng)物體內(nèi)的低酸和高膽鹽環(huán)境。上述研究發(fā)現(xiàn)碳酸鈣添加不僅可促進(jìn)芽孢形成提前，且促孢效果明顯，但該條件下所形成芽孢的抗逆性及是否會(huì)影響其作為益生菌使用仍需探究。為此，研究溫度、pH值、膽鹽對(duì)CGMCC 9951芽孢活性的影響。如圖6所示，該菌在碳酸鈣添加條件下形成的芽孢，經(jīng)過(guò)95 ℃水浴10 min后，芽孢存活率仍能高達(dá)81.25%。

圖6 溫度對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951芽孢活性的影響Fig. 6 Effect of temperature on spore activity of B. coagulans CGMCC 9951

胃酸環(huán)境是益生菌進(jìn)入體內(nèi)必須經(jīng)歷的一個(gè)關(guān)鍵過(guò)程，其酸耐受能力嚴(yán)重影響益生特性發(fā)揮。研究發(fā)現(xiàn)在碳酸鈣添加條件下形成的芽孢具有良好的耐酸性能，而在pH 3.0處理2 h后的芽孢萌發(fā)率仍達(dá)到76.79%；同時(shí)還觀察到，酸處理該芽孢還可促進(jìn)其快速萌發(fā)（表2）。在相同條件下，經(jīng)酸處理和未經(jīng)處理的芽孢萌發(fā)情況出現(xiàn)明顯差異，酸處理后的芽孢其萌發(fā)速度明顯高于對(duì)照組，在pH 3.0處理1 h時(shí)，芽孢萌發(fā)率是對(duì)照組的1.18 倍，pH 4.0處理1 h后芽孢萌發(fā)率是對(duì)照組的1.5 倍，pH 4.0處理2 h后的其萌發(fā)率仍然達(dá)到對(duì)照組的1.48 倍。

表2 凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951芽孢在酸處理后的萌發(fā)情況Table 2 Germination rate of B. coagulans CGMCC 9951 spores under acidic conditions

圖7 膽鹽對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951芽孢活性的影響Fig. 7 Effect of bile salt concentration on spore activity of B. coagulans CGMCC 9951

研究發(fā)現(xiàn)，CGMCC 9951在碳酸鈣添加情況下形成的芽孢，表現(xiàn)出較強(qiáng)的膽鹽耐受能力，其在0.3%膽鹽中處理2 h后保持99.79%的高芽孢存活率，即使在0.7%膽鹽條件下，芽孢存活率仍高達(dá)87.22%（圖7）。

2.3 碳酸鈣對(duì)啟動(dòng)芽孢形成相關(guān)基因的影響

圖8 碳酸鈣對(duì)芽孢化啟動(dòng)關(guān)鍵基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 8 Effect of CaCO3 on the relative expression levels of key genes involved in sporulation initiation

通過(guò)對(duì)GenBank中凝結(jié)芽孢桿菌DSM 1、S-lac、HM-08、BC-HY1、2-6、36D1、B4098、GED7749B等全基因組數(shù)據(jù)，以及本研究所用的CGMCC 9951誘導(dǎo)芽孢前后轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌中僅發(fā)現(xiàn)了2 個(gè)可激活芽孢化啟動(dòng)蛋白Spo0A的組氨酸激酶，分別為KinC和KinE。凝結(jié)芽孢桿菌中kinC和kinE是否能在碳酸鈣添加下大量表達(dá)，并激活Spo0A且達(dá)到芽孢化啟動(dòng)所需閾值，從而啟動(dòng)CGMCC 9951的芽孢化過(guò)程是揭示碳酸鈣誘導(dǎo)芽孢化啟動(dòng)機(jī)制的關(guān)鍵。以凝結(jié)芽孢桿菌ATCC 7050TkinC、kinE和spo0A基因序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)相關(guān)引物，在碳酸鈣添加情況下，對(duì)上述基因進(jìn)行real-time PCR分析，研究碳酸鈣添加對(duì)kinC、kinE、spo0A表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)16 h添加碳酸鈣后的2～4 h，kinC、kinE、spo0A的轉(zhuǎn)錄水平比未添加碳酸鈣組轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。18 h和20 h，kinC的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的2.20 倍和61.07 倍，kinE的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的6.63 倍和23.49 倍，spo0A的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的3.71 倍和17.32 倍。由此可見，碳酸鈣的添加，改變環(huán)境pH值條件，這種變化可能通過(guò)某種途徑激活了kinC、kinE的大量表達(dá)，從而對(duì)Spo0A進(jìn)行磷酸化并保持在較高水平，進(jìn)而誘導(dǎo)芽孢化啟動(dòng)進(jìn)程。

3 討論與結(jié)論

芽孢桿菌芽孢的形成主要受惡劣生存環(huán)境的影響，有研究證實(shí)大多芽孢桿菌芽孢化啟動(dòng)均是在中性偏堿環(huán)境下進(jìn)行[25]，而酸性條件則不利于芽孢起始[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，37 ℃條件下6%的碳酸鈣在培養(yǎng)16 h添加能有效改善環(huán)境pH值，極大促進(jìn)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951芽孢的產(chǎn)生。Dawes等[27]報(bào)道枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis 168）芽孢形成最適pH值為6.5～7.8，且在該范圍內(nèi)芽孢形成量恒定。Mazas等[28]報(bào)道蠟狀芽孢桿菌ATCC 7004、4342和9818芽孢形成的最適pH值為7.0，芽孢形成率均在90%左右，且在pH 6.5～8.3均能獲得良好的芽孢產(chǎn)量，而在最適pH值范圍外pH值升高或降低，細(xì)胞生長(zhǎng)和芽孢形成量均會(huì)降低。研究還發(fā)現(xiàn)，過(guò)量碳酸鈣添加將導(dǎo)致發(fā)酵液pH值快速上升，這不僅影響菌體的正常生長(zhǎng)代謝過(guò)程，而且超過(guò)了芽孢起始最適pH值范圍，從而影響了芽孢形成。因此適量碳酸鈣添加，有利于維持芽孢化啟動(dòng)環(huán)境形成，從而更好促進(jìn)芽孢大量啟動(dòng)，縮短芽孢形成進(jìn)程。

Moeller等[17]研究發(fā)現(xiàn)，芽孢形成介質(zhì)的組成影響芽孢對(duì)某些脅迫的抗性，在芽孢形成培養(yǎng)基中添加半胱氨酸、胱氨酸或硫脯氨酸制備的枯草芽孢桿菌芽孢對(duì)過(guò)氧化氫（H2O2）和環(huán)境相關(guān)的紫外線輻射（290～400 nm）的抗性高于用脯氨酸制備的芽孢或不加任何添加劑的芽孢。同時(shí)，Olivier等[18]證明解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、耐熱芽孢桿菌在高溫培養(yǎng)下形成的芽孢比較低溫度下形成的芽孢耐熱性能更強(qiáng)；而在培養(yǎng)基中添加礦物質(zhì)離子（Ca2+、Mn2+、Mg2+）形成的芽孢耐熱性能增加的同時(shí)降低了抗壓性能。凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951在碳酸鈣刺激下形成的芽孢在95 ℃存活率達(dá)81.25%，該特點(diǎn)能滿足益生菌制劑生產(chǎn)中高溫?cái)D壓成型的要求，可有效保持高的益生菌活性；同時(shí)CGMCC 9951在碳酸鈣刺激下形成的芽孢還表現(xiàn)出良好的耐酸性能，且酸環(huán)境刺激可加速其萌發(fā)，這為其益生特性發(fā)揮奠定了良好基礎(chǔ)。膽鹽是由肝細(xì)胞分泌的膽汁酸與甘氨酸或牛磺酸結(jié)合而形成的鈉鹽或鉀鹽，它主要參與脂肪的消化與吸收，腸道中的膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%～0.3%[6]。本實(shí)驗(yàn)條件下所獲得的CGMCC 9951芽孢能夠在0.03%～0.3%膽鹽中幾乎全部存活，使其較快適應(yīng)腸道環(huán)境，快速存活繁殖發(fā)揮益生作用。

眾所周知，芽孢形成是一個(gè)耗能和耗時(shí)的過(guò)程，當(dāng)菌體處于營(yíng)養(yǎng)饑餓狀態(tài)，細(xì)胞亞群間可能會(huì)優(yōu)先選擇向胞外釋放毒素蛋白進(jìn)行相互殘殺，并利用被殘殺的細(xì)胞釋放物作為自身生長(zhǎng)和細(xì)胞維持所需要的物質(zhì)，而非立即啟動(dòng)芽孢化進(jìn)程[29-30]。對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢化啟動(dòng)過(guò)程研究發(fā)現(xiàn)，KinA、KinB、KinC、KinD和KinE蛋白激酶均可通過(guò)磷酸中繼轉(zhuǎn)移系統(tǒng)激活芽孢化啟動(dòng)蛋白Spo0A。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期和穩(wěn)定期早期，主要為kinC、kinD、kinE表達(dá)，它們的產(chǎn)物可激活產(chǎn)生低濃度的Spo0A-P，而低濃度的Spo0A-P利于菌體生物膜的形成；在穩(wěn)定期后，kinA和kinB則大量表達(dá)，并激活產(chǎn)生大量的Spo0A-P，當(dāng)Spo0A-P積累達(dá)到一定閾值后，菌體便啟動(dòng)芽孢化進(jìn)程[29]。因此，KinA和KinB被認(rèn)為是激活Spo0A磷酸化并啟動(dòng)芽孢化最主要組氨酸激酶，Trach等[25]甚至認(rèn)為在缺乏kinA和kinB的菌株中幾乎觀察不到芽孢的形成。然而項(xiàng)目組研究卻發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期向培養(yǎng)基中添加一定量的碳酸鈣，能將kinC相對(duì)表達(dá)量提高到61.07 倍，kinE的相對(duì)表達(dá)量提高到23.49 倍，并誘發(fā)大量芽孢的形成，芽孢形成數(shù)量達(dá)到108CFU/mL以上。Ledeaux等[31-32]也發(fā)現(xiàn)在kinA和kinB雙缺失的枯草芽孢桿菌中，kinC的大量表達(dá)可誘導(dǎo)芽孢形成，同時(shí)其還可繞過(guò)spo0F和spo0B通過(guò)旁路途徑直接激活Spo0A，且KinC和KinE對(duì)Spo0F具有很強(qiáng)的親和力[29]。

分析發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌中的KinC和KinE，除C端催化區(qū)域比較保守外，N端信號(hào)感受區(qū)結(jié)構(gòu)卻明顯不同。KinC在枯草芽孢桿菌中由428 個(gè)氨基酸組成，由N端3 個(gè)跨膜區(qū)將其錨定在細(xì)胞膜上，并通過(guò)N端序列感知刺激信號(hào)；而凝結(jié)芽孢桿菌中的KinC由358 個(gè)氨基酸組成，與枯草芽孢桿菌的KinC同源性僅為42.4%，且未發(fā)現(xiàn)可能的跨膜區(qū)域，說(shuō)明其可能是以游離的形式存在胞質(zhì)中，并通過(guò)N端序列感知刺激信號(hào)?？莶菅挎邨U菌中KinE由738 個(gè)氨基酸構(gòu)成，其N端含有2 個(gè)PAS（Per ARNT Sim）結(jié)構(gòu)域，而凝結(jié)芽孢桿菌中的KinE則由504 個(gè)氨基酸構(gòu)成，與枯草芽孢桿菌同源性僅為50.64%，且N端僅含有1 個(gè)PAS結(jié)構(gòu)域。因此，凝結(jié)芽孢桿菌中如何感知細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境變化而啟動(dòng)kinC和kinE轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，而KinC和KinE是通過(guò)識(shí)別何種因子或與配基結(jié)合而被激活發(fā)生自磷酸化，隨后通過(guò)何種途徑激活Spo0A并啟動(dòng)芽孢化是本研究將持續(xù)關(guān)注問(wèn)題。

此外，對(duì)CGMCC 9951中KinC和KinE兩個(gè)激酶及芽孢啟動(dòng)主要調(diào)控因子Spo0A的表達(dá)量進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在碳酸鈣加入4 h后，芽孢形成基因kinC、kinE、spo0A的相對(duì)表達(dá)量顯著提高，且kinC相對(duì)表達(dá)量是kinE的2.6 倍，kinC在凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951芽孢化啟動(dòng)中是否承擔(dān)著主要作用，同時(shí)碳酸鈣的添加在改變pH值環(huán)境以及提供大量芽孢耐受性相關(guān)吡啶二羧酸鈣的同時(shí)，是否影響胞內(nèi)鈣庫(kù)水平，進(jìn)而引起鈣信號(hào)相關(guān)級(jí)聯(lián)反應(yīng)存在，都將是本研究在后續(xù)的工作中持續(xù)關(guān)注的問(wèn)題。