崔文斌，宋艷艷，李明華，張 麗,*，余群力，韓 玲，魏晉梅，郭兆斌

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實驗室，甘肅 蘭州 730070）

由于特殊的自然環(huán)境及自由的放牧方式，牦牛肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)物質(zhì)豐富，越來越引起國內(nèi)外學(xué)術(shù)界和商業(yè)界人士的廣泛關(guān)注。但是，由于肉及其制品在加工貯藏等過程中會不可避免受到溫度、氧氣和催化劑等外界因素的干擾，從而導(dǎo)致肉品質(zhì)量下降，品質(zhì)劣變嚴(yán)重[1]。在宰后肉品的成熟過程當(dāng)中，肌肉蛋白的氧化會導(dǎo)致側(cè)鏈氨基酸的氧化修飾，其中主要包括巰基氧化、芳香族羥基化和羰基的形成等化學(xué)變化[2]。肌原纖維蛋白的存在對肉品質(zhì)構(gòu)的形成具有至關(guān)重要的作用，并且蛋白質(zhì)的羰基化和羧基化與肌原纖維蛋白功能受損具有密不可分的聯(lián)系[3]。張麗等[4]通過研究肌肉蛋白氧化對肉品質(zhì)的影響發(fā)現(xiàn)，肌紅蛋白是肌肉中的天然組成成分，并被證實可以引發(fā)肌肉蛋白的氧化。早有研究證實，高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MetMb）是牛肉肌纖維中肌紅蛋白在低氧的情況下Fe2+轉(zhuǎn)變?yōu)镕e3+所形成的一種物質(zhì)，與此同時，MetMb含量的增加或減少也可以表征牛肉氧化程度的高低[5]。

研究表明，MetMb能夠與H2O2作用產(chǎn)生氧絡(luò)合鐵色素和蛋白自由基。Xiong[6]和Ooizumi[7]等通過這種反應(yīng)建立了模擬MetMb氧化的體系，在此體系中研究了MetMb對肌原纖維蛋白氧化的影響，并發(fā)現(xiàn)MetMb氧化體系對肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的影響很大，尤其是肌球蛋白。并且在與羥自由基氧化體系實驗結(jié)果進(jìn)行分析對比后發(fā)現(xiàn)，MetMb氧化體系能誘發(fā)更為劇烈的蛋白氧化。研究表明，過氧化氫能夠與MetMb發(fā)生反應(yīng)生成某些肌紅蛋白前體物質(zhì)，這種前體物質(zhì)的性質(zhì)相當(dāng)不穩(wěn)定，它能夠以最快速度轉(zhuǎn)變形成超鐵肌紅蛋白，而這種前體物質(zhì)與超鐵肌紅蛋白都具有能夠促進(jìn)肉品中脂質(zhì)氧化的強(qiáng)大能力[8]。Promeyrat等[9]通過研究發(fā)現(xiàn)，肌紅蛋白含量的高低是預(yù)測肉品中羰基生成的一個重要的標(biāo)志，這在一定程度上表明了肌紅蛋白是肌原纖維蛋白羰基化的有效促進(jìn)劑。Estévez等[10]研究發(fā)現(xiàn)，過氧化氫存在條件下，肌紅蛋白比銅離子和鐵離子等金屬離子與過氧化氫的作用更能促進(jìn)肌原纖維蛋白生成氧化產(chǎn)物，并且研究指出，肌紅蛋白含量的高低可以影響脂肪氧化，與這種影響機(jī)理類似的是，在肌紅蛋白氧化過程中會生成H2O2和羥自由基等活性氧物質(zhì)，而這些物質(zhì)可以進(jìn)一步促進(jìn)蛋白質(zhì)發(fā)生氧化；與此同時，蛋白質(zhì)的氧化產(chǎn)物MetMb同樣具有促進(jìn)蛋白質(zhì)發(fā)生氧化的能力。Decker等[11]研究發(fā)現(xiàn)，三價鐵與抗壞血酸作用能夠積極地誘導(dǎo)肌原纖維蛋白氧化生成羰基化合物。陳騁[12]對牦牛肉肌紅蛋白穩(wěn)定性的研究發(fā)現(xiàn)，為適應(yīng)低氧高寒環(huán)境，牦牛肉中肌紅蛋白的含量高于平原地區(qū)的牛，而由這種特性引起MetMb氧化進(jìn)而使肌原纖維蛋白發(fā)生氧化的研究鮮有報道，有必要對其進(jìn)行深入探討。

因此，本實驗通過建立MetMb氧化體系，選取甘南牦牛背最長肌，將提取的肌原纖維蛋白于4 ℃氧化孵育24 h，并系統(tǒng)探究氧化系統(tǒng)中蛋白結(jié)構(gòu)的變化，對其生化特性進(jìn)行研究。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)各指標(biāo)的變化規(guī)律及相互關(guān)系比較不同處理組牦牛肉宰后肌原纖維蛋白生化特性的變化，探究MetMb氧化對牦牛肉肌原纖維蛋白生化特性的影響規(guī)律，以期為牦牛肉生產(chǎn)加工過程中蛋白氧化控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隨機(jī)選取甘肅甘南藏族自治州同一牧場健康無病的（36±6）月齡牦牛6 頭，平均體質(zhì)量（250±50）kg。宰后在其左半胴體現(xiàn)場采集背最長肌，在0～4 ℃條件下現(xiàn)場分割成2 cm×2 cm×3 cm長條狀肉樣，錫箔紙包裝，置于液氮罐運(yùn)輸至實驗室，于超低溫冰箱-80 ℃凍藏待測。

H2O2、三氯乙酸、鹽酸胍、FeCl3、抗壞血酸、溴酚藍(lán)、甘氨酸、肌紅蛋白（馬心?。⑴Ｑ灏椎鞍?、2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、哌嗪-N,N′-雙(2-乙磺酸)（1,4-piperazinebis(ethanesulfonic acid)，PIPES）） 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) 美國Sigma公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

XH-B型渦旋混合器 江蘇康健醫(yī)療用品有限公司；PHS-3C型pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；756P紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī) 長沙湘儀有限公司；XHF-D型高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；HX202T電子天平 慈溪市天東衡器廠。

1.3 方法

1.3.1 MetMb氧化模型構(gòu)建

參考Park等[13]的方法。MetMb溶液濃度分別為0、0.3、0.4、0.5 mmol/L。肌原纖維蛋白分散于上述氧化體系中（最終質(zhì)量濃度為20 mg/mL，4 ℃氧化24 h后用1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）終止反應(yīng)。上述氧化反應(yīng)均在15 mmol/L PIPES緩沖溶液（pH 6.0，0.6 mol/L NaCl）中進(jìn)行。空白對照為未處理的肌原纖維蛋白。然后通過用pH 7.0的5 倍體積15 mmol/L PIPES緩沖液（無NaCl）洗滌肌原纖維蛋白樣品，1 000×g離心15 min除去氧化劑。將蛋白質(zhì)沉淀重新懸浮在3 倍體積的含有0.1 mol/L NaCl（pH 7.0）的15 mmol/L PIPES緩沖液中，1 000×g離心15 min，得到肌原纖維蛋白沉淀。蛋白濃度用雙縮脲法測定。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

參照Park等[13]的方法略作修改。稱取5 g肉樣，加入10 倍體積標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液（20 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH 6.8），13 000 r/min勻漿10 s，4 ℃、1 000×g離心10 min，并棄去上清液。沉淀用8 倍體積標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液溶解后，4 ℃、1 000×g離心10 min，棄去上清液，重復(fù)操作2 次。沉淀用8 倍體積的100 mmol/L KCl溶液溶解，然后4 ℃、1 000×g離心10 min，并棄去上清液，重復(fù)2 次。最終所得沉淀中加入4 mL 20 mmol/L磷酸鈉緩沖溶液（pH 6.25），用雙縮脲法測定其蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 羰基濃度的測定

參考Levine等[14]的方法，并略作修改。在10 mL的離心管中加入終止氧化后的蛋白質(zhì)溶液0.5 mL與2 mL 2,4-二硝基苯肼的HCl溶液，置于25 ℃反應(yīng)40 min，空白樣品中不加2,4-二硝基苯肼。然后加入20%三氯乙酸溶液2 mL，振蕩后11 000×g離心5 min，倒掉上清液。蛋白質(zhì)沉淀用乙醇-乙酸乙酯溶液（1∶1，V/V）洗滌3 次，揮發(fā)完溶劑后將蛋白質(zhì)懸浮于3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液中，于37 ℃水浴保溫30 min，370 nm波長處測定吸光度。以空白為對照，采用分子吸光系數(shù)22 000 mol/（L·cm）計算羰基濃度。

1.3.4 巰基濃度的測定

參考Korchak等[15]的方法測定。

1.3.5 二硫鍵濃度測定

參考Thannhauser等[16]的方法，并略作修改。調(diào)整蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為5 mg/mL。取100 μL稀釋后的蛋白液與3 mL新鮮配制的NTSB溶液混合，在室溫避光反應(yīng)25 min，然后在412 nm波長處測定吸光度（A）。以0.1 mL 20 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.25）作空白對照。采用分子吸光系數(shù)13 600 mol/（L·cm）進(jìn)行計算。

1.3.6 Ca/K-ATPase活性測定

參考Wells等[17]的方法，并略作修改。反應(yīng)液A：0.18 mol/L Tris-HCl緩沖液（0.15 mmol/L KCl、15 mmol/L CaCl2、7.6 mmol/L ATP，pH 7.4），測定Ca-ATPase活性。反應(yīng)液B：0.18 mol/L Tris-HCl緩沖液（7.6 mmol/L ATP、0.3 mol/L KCl、5.0 mmol/L EDTA，pH 7.4），測定K-ATPase活性。用15 mmol/L PIPES（0.6 mol/L NaCl，pH 6.25）將蛋白液稀釋為2 mg/mL，取0.2 mL稀釋液分別與2 mL反應(yīng)液A或B在25 ℃培養(yǎng)10 min后，加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，然后4 ℃、2 500×g離心5 min，取1 mL上清液，加入3.0 mL 0.66%鉬酸銨（溶解在0.375 mol/L硫酸溶液）和0.5 mL新鮮配制的10% FeSO4溶液（溶解在0.075 mol/L硫酸溶液），反應(yīng)2 min后于700 nm波長處讀數(shù)?；钚越Y(jié)果表示為μmol/（mg·10 min），0～1.0 mmol/L NaH2PO4溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用于磷酸鹽計算。

1.3.7 二聚酪氨酸測定

參考Davies等[18]的方法并略加修改。將含有20 mg肌原纖維蛋白的懸浮液溶于10 mL高離子強(qiáng)度緩沖液（0.6 mol/L，pH 6.0、20 mol/L磷酸緩沖液）中，濾紙過濾除去殘留脂肪和不溶性物質(zhì)。濾液用雙縮脲法測蛋白含量，用牛血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線，y = 0.061 3x-0.000 6，x為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL），y為吸光度。熒光光度法測定濾液中二酪氨酸含量，測定條件為：發(fā)射波長420 nm（狹縫5 nm），激發(fā)波長325 nm（狹縫5 nm）。測定結(jié)果用熒光強(qiáng)度除以蛋白濃度，表示為相對熒光值。

1.3.8 表面疏水性測定

參考Chelh等[19]的方法測定。

1.3.9 肌原纖維小片化指數(shù)（myofibrillar fragmentation index，MFI）的測定

參考Culler等[20]的方法測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗每個處理重復(fù)3 次。采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用SPSS 19.0 Duncan法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05，顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 羰基濃度的變化

由圖1可知，經(jīng)MetMb體系氧化24 h的肌原纖維蛋白羰基濃度呈上升趨勢，當(dāng)MetMb濃度升高至0.5 mmol/L時，羰基濃度增加至最大值10.11 nmol/mL，較空白對照組升高了近4 倍，與空白對照組（0 mmol/L）2.26 nmol/mL差異顯著（P＜0.05）?？赡苁且驗殡S著MetMb濃度的增加，牦牛肉肌原纖維蛋白氧化程度加劇導(dǎo)致的。

圖1 牦牛肉肌原纖維蛋白羰基濃度的變化Fig. 1 Changes in carbonyl content of myofibrillar protein in yak meat

2.2 巰基濃度的變化

圖2 牦牛肉肌原纖維蛋白巰基濃度的變化Fig. 2 Changes in sulfhydryl content in myofibrillar protein of yak meat

由圖2可知，隨著MetMb濃度的增加，經(jīng)MetMb體系氧化的肌原纖維蛋白巰基濃度呈下降趨勢，當(dāng)MetMb濃度為0.5 mmol/L時，巰基濃度降至41.18 nmol/mL，較空白對照組顯著降低（P＜0.05），下降31.5%。

2.3 二硫鍵濃度的變化

圖3 牦牛肉肌原纖維蛋白二硫鍵濃度的變化Fig. 3 Changes in disulfide bond content in myofibrillar protein of yak meat

由圖3可知，隨著MetMb濃度的增加，經(jīng)MetMb體系氧化的肌原纖維蛋白二硫鍵濃度呈上升趨勢，當(dāng)MetMb濃度為0.5 mmol/L時，二硫鍵濃度與空白對照組相比顯著增加了約3.5 倍（P＜0.05）。肌原纖維蛋白含有大量自由巰基，這些巰基很容易被氧化而轉(zhuǎn)化成分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，這也是氧化過程中肌原纖維蛋白聚合的主要途徑，綜上，隨著MetMb濃度的增加，肌原纖維蛋白中大量巰基轉(zhuǎn)換成二硫鍵，蛋白氧化程度加深。

2.4 Ca/K-ATPase活性的變化

圖4 牦牛肉肌原纖維蛋白Ca-ATPase活性的變化Fig. 4 Changes in Ca-ATPase activity of myo fibrillar protein in yak meat

由圖4可知，隨著MetMb濃度的增加，經(jīng)MetMb體系氧化的肌原纖維蛋白Ca-ATPase活性總體呈上升趨勢，MetMb濃度為0.5 mmol/L時，Ca-ATPase活性顯著增加至1.343 μmol/（mg·10 min）（P＜0.05）。ATPase活性是反映肌球蛋白完整性的指標(biāo)，肌球蛋白頭部催化中心有兩個活性巰基（—SH1和—SH2）?！猄H1影響Ca-ATPase活性，而—SH1和—SH2同時影響K-ATPase活性。綜上，在氧化過程中—SH1發(fā)生了較大程度的變性。

圖5 牦牛肉肌原纖維蛋白K-ATPase活性的變化Fig. 5 Changes in K-ATPase activity of myo fibrillar protein in yak meat

由圖5可知，隨著MetMb濃度的增加，經(jīng)MetMb體系氧化的肌原纖維蛋白K-ATPase活性總體呈下降趨勢。當(dāng)MetMb濃度為0.5 mmol/L時，K-ATPase活性降低至最低，與空白對照組相比顯著降低36.62%（P＜0.05）。肌球蛋白頭部催化中心的兩個活性巰基（—SH1和—SH2）同時影響K-ATPase活性。綜上，在氧化過程中，—SH1和—SH2均嚴(yán)重變性。

2.5 二聚酪氨酸的變化

圖6 牦牛肉肌原纖維蛋白二聚酪氨酸的變化Fig. 6 Changes in dimer tyrosine content of myofibrillar protein in yak meat

由圖6可知，隨著MetMb濃度的增加，相對熒光值呈上升趨勢，在MetMb濃度低于0.01 mmol/L時，其相對熒光值上升緩慢，當(dāng)濃度增加至0.5 mmol/L時，相對空白對照，相對熒光值增加了近1 倍（P＜0.05）。

2.6 表面疏水性的變化

圖7 牦牛肉肌原纖維蛋白表面疏水性的變化Fig. 7 Changes in surface hydrophobicity of myofibrillar protein in yak meat

由圖7可知，隨著MetMb濃度的增加，經(jīng)MetMb體系氧化的肌原纖維蛋白表面疏水性呈上升趨勢。當(dāng)MetMb濃度為0.5 mmol/L時，溴酚藍(lán)結(jié)合量較空白對照組增加1 倍左右（P＜0.05）。隨MetMb濃度的增加，蛋白聚集解折疊程度大于其再折疊程度，表面疏水性逐漸增加。

2.7 MFI的變化

圖8 牦牛肉肌原纖維蛋白MFI的變化Fig. 8 Changes in myofibrillar fragmentation index of myofibrillar protein in yak meat

由圖8可知，牦牛肉肌原纖維蛋白在MetMb濃度為0 mmol/L時MFI為23.86，0.5 mmol/L時達(dá)最大值55.27。從濃度為0.01 mmol/L開始，MFI呈增加趨勢，顯著小于0.05 mmol/L和0.5 mmol/L時的MFI（P＜0.05）。

2.8 各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

通過對MetMb氧化牦牛肉肌原纖維蛋白過程中各指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，其Pearson相關(guān)系數(shù)如表1所示。由表1可知，牦牛肉肌原纖維蛋白在MetMb氧化過程中，除羰基濃度與巰基濃度（r=-0.978，P＜0.01）、K-ATPase活性（r=-0.972，P＜0.01）呈極顯著負(fù)相關(guān)外，與其他指標(biāo)均呈極顯著正相關(guān)。羰基濃度的變化是最能夠表征蛋白氧化程度的指標(biāo)，結(jié)果分析表明各指標(biāo)均與羰基濃度呈極顯著相關(guān)，由此可知MetMb氧化對牦牛肉肌原纖維蛋白的氧化產(chǎn)生了顯著影響。

表1 各指標(biāo)間的Pearson相關(guān)系數(shù)Table 1 Pearson correlation coefficients among various indexes

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，肌紅蛋白含量的高低是對肉色深淺最直觀的表征，肌紅蛋白含量越高則肉色越深，而為了適應(yīng)低氧高寒環(huán)境，牦牛肉中肌紅蛋白的含量高于平原地區(qū)的牛[12]，因此，有必要對由這種特性引起的MetMb氧化進(jìn)而對其肌原纖維蛋白氧化產(chǎn)生的影響進(jìn)行深入探討。Promeyrat等[9]通過對宰后豬肉蛋白氧化研究發(fā)現(xiàn)，肌紅蛋白含量增加能夠?qū)е氯庵恤驶鶟舛鹊纳仙＿@與本研究中通過調(diào)整MetMb濃度，構(gòu)建MetMb氧化體系并分析表征蛋白氧化結(jié)構(gòu)和生化特性變化的各指標(biāo)中，羰基濃度顯著升高這一結(jié)果相一致。同時，Savd等[21]通過對宰后豬肉早期肌漿蛋白氧化研究表明，肌紅蛋白是肌原纖維蛋白氧化的有效促進(jìn)劑。在本研究中，通過各氧化指標(biāo)間相關(guān)性分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牦牛肉肌原纖維蛋白在MetMb氧化過程中其羰基濃度除與巰基濃度、K-ATPase活性呈極顯著負(fù)相關(guān)外，與其他指標(biāo)均呈極顯著正相關(guān)。這表明在MetMb氧化體系中，牦牛肉肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，表征氧化程度的指標(biāo)對此氧化體系敏感，這可能是由于肌紅蛋白氧化過程中生成的H2O2和羥自由基等活性氧物質(zhì)進(jìn)一步促進(jìn)了蛋白質(zhì)氧化[22]。李春強(qiáng)[23]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白氧化過程中，MetMb會在肌肉中積累，并與H2O2反應(yīng)生成超價態(tài)（Fe4+）的肌紅蛋白種類，這類物質(zhì)可以促進(jìn)蛋白發(fā)生氧化，這與本研究中MetMb促進(jìn)肌原纖維蛋白發(fā)生氧化結(jié)果一致。此外，自由基從超價態(tài)肌紅蛋白轉(zhuǎn)移到其他肌肉蛋白上則會生成蛋白自由基并引發(fā)蛋白氧化[24-25]，這從深層次確證了本實驗構(gòu)建MetMb氧化體系導(dǎo)致肌原纖維蛋白發(fā)生氧化的理論依據(jù)。

本研究中，隨著MetMb濃度升高，巰基濃度逐漸減少，且二硫鍵濃度逐漸增加，當(dāng)MetMb濃度為0.5 mmol/L時，巰基濃度與空白對照組呈顯著差異（P＜0.05），二硫鍵濃度與空白對照組差異顯著（P＜0.05）。Souza等[8]通過對大鼠額葉皮質(zhì)中的蛋白氧化研究發(fā)現(xiàn)，H2O2還能與MetMb發(fā)生反應(yīng)生成活性中間產(chǎn)物MetMb-H2O2和超鐵（+4價）肌紅蛋白前體物質(zhì)，這種前體物質(zhì)極不穩(wěn)定，可以迅速轉(zhuǎn)變成超鐵肌紅蛋白，MetMb-H2O2和超鐵肌紅蛋白均具有促進(jìn)肉中脂質(zhì)氧化的強(qiáng)大能力，脂質(zhì)氧化進(jìn)而促進(jìn)蛋白氧化，致使巰基濃度減少、二硫鍵濃度增加，這與本實驗結(jié)果一致。張麗等[26]研究發(fā)現(xiàn)，牦牛肉氧化21 d相比于氧化7 d，其MFI值顯著升高，這與本研究中高濃度（MetMb濃度為0.5 mmol/L）氧化期間MFI值顯著高于對照處理組MFI值結(jié)果一致。Irwin等[27]研究表明，與肌紅蛋白介導(dǎo)脂肪氧化類似，肌紅蛋白氧化過程中生成的H2O2和羥自由基等活性氧物質(zhì)能促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化；此外，氧化產(chǎn)物MetMb也具有促進(jìn)蛋白氧化的能力；肌紅蛋白發(fā)生解離后，釋放的血紅素和鐵離子同樣具有促進(jìn)肌原纖維蛋白氧化的能力[28]。本研究中，隨著MetMb濃度升高，溴酚藍(lán)結(jié)合量呈上升后下趨勢（P＜0.05），蛋白質(zhì)表面疏水性增加，說明MetMb氧化產(chǎn)生的超鐵肌紅蛋白可以促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化作用的進(jìn)行。

4 結(jié) 論

經(jīng)不同濃度MetMb氧化處理的牦牛肉肌原纖維蛋白，隨著MetMb濃度的增加，羰基濃度呈顯著增加趨勢，二硫鍵、表面疏水性和Ca-ATPase活性、二聚酪氨酸、MFI也發(fā)生不同程度的增加，巰基濃度和K-ATPase活性均呈現(xiàn)不同程度的降低，巰基在氧化濃度為0.5 mmol/L時下降顯著；K-ATPase活性在高氧化濃度時下降程度更為明顯。MetMb濃度越高，牦牛肉肌原纖維蛋白氧化程度加劇，肌球蛋白頭部活性巰基—SH1和—SH2均嚴(yán)重變性。