周 揚，陳雪珂，戴宏杰，余 永，朱瀚昆，王洪霞，張宇昊*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

肌球蛋白是肉及肉制品中最主要的蛋白質(zhì)，約占肌肉總蛋白的1/3，是蛋白功能特性的主要承擔(dān)者，對肉制品品質(zhì)起關(guān)鍵性作用[1-2]。迷迭香是肉制品加工、貯藏等過程中常見的調(diào)料，賦予了產(chǎn)品特殊風(fēng)味并起到抗氧化等作用，其中起主要作用的成分為多酚類化合物。迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）是一種水溶性多酚，被鑒定為迷迭香提取物的主要成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗血栓生成、抗菌等生物活性，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[3]。

目前，將RA或迷迭香提取物用于延緩肉類制品的脂肪氧化和蛋白質(zhì)氧化已有報道。高輝等[4]在火腿腸中添加了適量RA，有效延緩了火腿腸的脂肪氧化。張曉潔[5]將RA添加到明膠膜中用于豬肉的保鮮研究，結(jié)果表明RA可以提高明膠膜的抗氧化性，延緩臘肉的脂質(zhì)氧化。此外，也有將迷迭香提取物添加到肉類產(chǎn)品中，賈娜等[6]將迷迭香提取物添加到雞肉糜中，具有抑制雞肉糜在冷藏過程中的脂肪氧化作用，并改善了肉制品的品質(zhì)。其中，RA等多酚類物質(zhì)會與肉制品中的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，進而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征和理化特性，導(dǎo)致其功能特性發(fā)生改變。諸多研究表明，蛋白質(zhì)與多酚類化合物之間的相互作用分為可逆的非共價相互作用和不可逆的共價相互作用，但因為蛋白質(zhì)的高度復(fù)雜性、多酚的多反應(yīng)活性、蛋白與多酚種類及反應(yīng)條件的不同，其相互作用呈現(xiàn)出復(fù)雜性。目前，關(guān)于肉類蛋白與RA的互作研究大部分都基于氧化條件下對于蛋白凝膠特性的影響。而在非氧化條件下，肌球蛋白與RA在溶液體系中的相互作用及其與蛋白理化特性的內(nèi)在聯(lián)系的研究較少。

本研究以肌球蛋白和RA為原料制備混合溶液，運用熒光光譜、圓二色譜、電泳等方法表征RA與肌球蛋白的相互作用，并測定不同鹽濃度條件下肌球蛋白的構(gòu)象變化和功能特性等指標(biāo)，旨在探究溶液狀態(tài)下RA與肌球蛋白的相互作用及其對肌球蛋白理化特性的影響，并闡明相關(guān)機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬里脊肉、大豆油 重慶市北碚區(qū)永輝超市；RA（純度97%） 上海阿拉丁試劑公司；甘氨酸生工生物工程上海有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、過硫酸銨、β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）、三羥甲基氨基甲烷（Tris，分析純）、四甲基乙二胺、考馬斯亮藍R-250（分析純） 上海佰曄生物科技中心；標(biāo)準(zhǔn)蛋白（分子質(zhì)量10～200 kDa） 加拿大Fermentas公司；三磷酸腺苷二鈉鹽、乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸（ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid，EGTA）、5,5-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、溴酚藍（bromophenol blue，BPB）、丙烯酰胺（分析純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%） 北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉成都市科龍化工試劑廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JA3003B型電子天平 上海精天電子儀器有限公司；PHS-25型數(shù)顯酸度計 杭州雷磁分析儀器廠；QL 901 Vortex型渦旋混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；XHF-D型高速分散器 寧波新芝有限公司；Heraeus Multifuge X3R型高速冷凍離心機 美國賽默飛世爾科技公司；722-P型紫外-可見光分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；F-4500型熒光分光光度計 日本日立公司；Power PacTM型基礎(chǔ)電泳儀 美國Bio-Rad公司；G:BOX EF型凝膠成像系統(tǒng) 英國Syngene公司；MOS-500型圓二色譜儀 法國Bio-Logic公司；ZEN3690型粒度儀 英國馬爾文儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

參照Liu Ru等[7]的方法略作修改。為了防止蛋白質(zhì)變性和蛋白質(zhì)水解，用于制備肌球蛋白的溶液要在4 ℃進行保存。取豬里脊肉，切成肉糜狀，加入10 倍體積的試劑A（0.1 mol/L KCl，20 mmol/L Tris-HCl緩沖液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.5）。用均質(zhì)機在10 000 r/min條件下將其均質(zhì)1 min?；旌衔镌? ℃放置15 min，5 000 r/min、4 ℃離心5 min。取沉淀，加入5 倍體積的試劑B（0.45 mol/L KCl，5 mmol/L β-ME，0.2 mol/L乙酸鎂，1 mmol/L EGTA，20 mmol/L Tris-HCl緩沖液，用馬來酸調(diào)節(jié)pH值至6.8），再加ATP，使其最終濃度為10 mmol/L，混合物在4 ℃放置90 min，10 000 r/min、4 ℃離心10 min。取上清液，加入5 倍體積的1 mmol/L KHCO3進行緩慢稀釋，4 ℃放置20 min，10 000 r/min離心10 min（4 ℃）。取沉淀，加入2.5 倍體積的試劑C（0.5 mol/L KCl，5 mmol/L β-ME，20 mmol/L Tris-HCl緩沖液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.5），4 ℃保存10 min，然后緩慢加入7 倍體積的1 mmol/L KHCO3，同時，加入MgCl2使其最終濃度為10 mmol/L。將形成的混合物在4 ℃保存12 h，10 000 r/min、4 ℃離心10 min。取沉淀物，即為肌球蛋白，4 ℃保存，3 d內(nèi)使用，肌球蛋白含量的測定采用雙縮脲法。

1.3.2 肌球蛋白-RA混合液的制備

將提取的肌球蛋白分散于20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）緩沖液中，并與RA溶液（溶于相同緩沖液）混合均勻，RA添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%。向混合液中加入固體NaCl，使NaCl的最終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L，攪拌均勻，得到一系列不同鹽濃度條件下的肌球蛋白-RA混合液（myosin-rosmarinic acid，M-RA）。對照組（M）不含RA。

1.3.3 色氨酸熒光測定

采用熒光分光光度儀檢測肌球蛋白的內(nèi)源色氨酸熒光[8]。室溫下，將肌球蛋白分散于20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）中，將RA溶液（溶于相同緩沖液）按照不同比例混合，得到一系列混合溶液，其最終肌球蛋白質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，RA質(zhì)量濃度為0～0.014 mg/mL?；旌暇鶆蚝鬁y量在3 個不同溫度（298、308、318 K）條件下的肌球蛋白熒光光譜。激發(fā)波長為295 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設(shè)置為5 nm，掃描范圍為300～500 nm。

Stern-Volmer方程：

式中：F0和F分別為淬滅劑不存在和存在的熒光強度；KSV為速率常數(shù)/（L/mol）；Kq為猝滅常數(shù)/（L/（mol·s））；[Q]為淬滅劑的濃度/（mol/L）；生物大分子τ0=10-8s-1。

Lineweaver-Burk靜態(tài)猝滅公式：

式中：Ka為表觀結(jié)合常數(shù)/（L/mol）；n為結(jié)合位點；[Q]為熒光猝滅劑的濃度/（mol/L）。

Van’t Hoff等式：

式中：K為溫度T時的結(jié)合常數(shù)；R為氣體常數(shù)；ΔH為焓變；ΔS為熵變；ΔG為吉布斯自由能。

1.3.4 表面疏水性

參照Chelh等[9]的方法略作修改。將樣品調(diào)至蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL，取2 mL樣液于離心管中，分別加入60 μL的1 mg/mL溴酚藍溶液，振蕩均勻，10 000 r/min離心10 min。取上清液再次離心后于595 nm波長處測定吸光度。以緩沖溶液為空白對照，蛋白結(jié)合的BPB含量作為疏水性指標(biāo)，計算如式（5）所示：

1.3.5 總巰基測定

參照Liu Jianhua等[10]的方法，并略作修改。將樣品調(diào)至蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL，取1 mL樣液懸浮于2 mL的Tris-甘氨酸緩沖液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，4 mmol/L EDTA，8 mol/L尿素，pH 8.0）中，加入0.5 mL 10 mmol/L Ellman試劑（0.2 g DTNB溶解于50 mL的Tris-甘氨酸緩沖液中），混合均勻后靜置30 min，于412 nm波長處測吸光度。以緩沖溶液為空白對照，計算如式（6）所示：

式中：A為412 nm波長處的吸光度，ρ為樣品的蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.6 電泳分析

制備12%分離膠、4%濃縮膠。將樣品調(diào)至蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL，取20 μL樣品并添加5 μL樣品緩沖液（250 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8）、0.1 g/mL十二烷基硫酸鈉、5 mg/mL溴酚藍、體積分?jǐn)?shù)50%甘油、體積分?jǐn)?shù)5% β-ME，沸水浴5 min后立即于冰水浴中冷卻，上樣量為10 μL。電流為15 mA，待溴酚藍從濃縮膠跑到分離膠中部后，電流調(diào)至25 mA，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍R-250染色液進行染色，2 h后用脫色液振蕩脫色，待條帶清晰后拍攝電泳圖譜。

1.3.7 圓二色譜掃描

采用圓二色譜儀測定肌球蛋白的二級結(jié)構(gòu)。將樣品調(diào)至蛋白質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，圓二色譜掃描波長范圍為190～250 nm，掃描速率為100 nm/min，樣品池光徑為1 mm。以緩沖液為空白對照，計算如式（7）所示：

式中：[θ]222為2 2 2 n m波長處的摩爾橢圓率/（deg·cm2/dmol）；[θ]obs為222 nm波長處的橢圓率/mdeg；mw為肌球蛋白的平均殘基分子質(zhì)量，取115 g/mol；ρ為肌球蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；L為比色皿光程長度/mm。

1.3.8 溶解度和濁度測定

溶解度：將樣品調(diào)至蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，測定上清液中的蛋白濃度，蛋白溶解度計算如式（9）所示：

濁度：將樣品調(diào)至蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL，于370 nm波長處測定吸光度。

1.3.9 Zeta電位和粒徑測定

采用馬爾文粒徑儀測定肌球蛋白樣品的電位和粒徑分布。將樣品調(diào)至蛋白質(zhì)量濃度0.5 mg/mL，粒度分析儀為He-Ne光源，功率5 mW，散射角90°，平衡時間60 s。

1.3.10 乳化特性測定

采用濁度法測定肌球蛋白的乳化性質(zhì)[11]。將樣品調(diào)至蛋白質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，取8.0 mL置于離心管中，并加入2.0 mL大豆油，10 000 r/min均質(zhì)1 min，立即從距離心管底0.5 cm的地方取勻漿液50 μL，加入到5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS溶液中，振蕩混勻后于500 nm波長處測定吸光度記為A0；靜置10 min再次在相同的位置取勻漿液50 μL，加入到5 mL相同SDS溶液中，振蕩混勻后測定吸光度記為A10。以0.1% SDS溶液為空白對照，乳化活力和乳化穩(wěn)定性的計算公式如下：

式中：A0、A10為乳狀液在第0、10分鐘的吸光度；φ為油相體積分?jǐn)?shù)（φ=0.2）；C為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0和Origin 8.0軟件，每次實驗重復(fù)3 次。在分析過程中對數(shù)據(jù)進行方差分析，利用Duncan多重比較進行顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光光譜分析

2.1.1 色氨酸熒光結(jié)果

圖1 RA對肌球蛋白內(nèi)源熒光的淬滅作用Fig. 1 Effect of RA concentration on tryptophan fluorescence of myosin

表1 不同溫度下RA與肌球蛋白相互作用的猝滅常數(shù)（Kq）和速率常數(shù)（Ksv）Table 1Stern-Volmer quenching constants for M-RA system at different temperatures

在一定的激發(fā)波長下，蛋白質(zhì)分子中的芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）可以產(chǎn)生熒光，其中，色氨酸的熒光最強[12]。蛋白溶液中添加多酚后，可能會導(dǎo)致熒光強度降低，即熒光猝滅，故可以通過研究蛋白的色氨酸熒光了解蛋白與多酚之間的相互作用。如圖1A所示，當(dāng)激發(fā)波長為295 nm時，肌球蛋白被激發(fā)后展現(xiàn)出很強的熒光強度。隨RA添加量的增加，肌球蛋白的熒光強度逐漸降低，且伴隨著最大發(fā)射峰出現(xiàn)明顯的紅移現(xiàn)象（從332 nm移至344 nm），說明RA對于肌球蛋白內(nèi)源熒光具有明顯的猝滅作用，二者可能通過相互作用促使蛋白結(jié)構(gòu)展開，進而使色氨酸從蛋白內(nèi)部疏水性位置暴露到極性環(huán)境中[13]。

一般而言，導(dǎo)致蛋白質(zhì)熒光猝滅的方式通?？煞譃閯討B(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。為進一步闡明RA對肌球蛋白的猝滅機理，采用經(jīng)典Stern-Volmer方程對熒光數(shù)據(jù)進行分析[14]。如圖1B、表1所示，隨溫度升高，猝滅曲線的斜率（Ksv）逐漸降低，且猝滅常數(shù)Kq遠(yuǎn)大于最大動態(tài)猝滅常數(shù)（2.0×1010L/（mol·s））[15]，說明RA引起的肌球蛋白熒光猝滅是分子之間結(jié)合形成復(fù)合物所引起的靜態(tài)熒光猝滅，而不是由分子擴散和碰撞所引起的動態(tài)熒光猝滅。

2.1.2 結(jié)合情況和作用力類型判斷

表2 不同溫度下RA與肌球蛋白結(jié)合的相關(guān)常數(shù)和方程Table 2Regression equations and correlation coef ficients for RA-M system at different temperatures

表3 RA和肌球蛋白相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of interaction between RA and myosin

如表2所示，溫度對肌球蛋白與RA的結(jié)合常數(shù)影響不大，Ka值均大于104L/mol，且可形成一個結(jié)合位點，表明RA與肌球蛋白之間結(jié)合力很好。

如表3所示，通過反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)的計算可大致確定作用力的類型。肌球蛋白與RA的作用過程是一個放熱過程（ΔH＜0），熵增過程（ΔS＞0）及自發(fā)過程（ΔG＜0），且熵增加是肌球蛋白與RA相互作用過程的主要驅(qū)動力。在水溶液中，ΔS＞0，可認(rèn)為二者之間主要的作用力為疏水作用，這是因為水溶液中有離子間的靜電作用使得ΔH＜0[16]。因此，肌球蛋白與RA之間以疏水相互作用為主，還包括氫鍵和范德華力等，如圖2所示。He Wenjia等[17]分析熱力學(xué)結(jié)果得到，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）與β-乳球蛋白主要通過氫鍵和疏水相互作用結(jié)合，C3G與β-酪蛋白則主要通過氫鍵和范德華力進行相互作用。這些不同的結(jié)果可能是由于蛋白和多酚種類及狀態(tài)不同所致。

2.2 表面疏水性分析

圖2 不同NaCl濃度下RA對肌球蛋白表面疏水性的影響Fig. 2 Effect of RA on surface hydrophobicity of myosin at different NaCl concentrations

如圖2所示，當(dāng)NaCl濃度從0.2 mol/L增加至0.6 mol/L時，兩組疏水性均呈顯著減少的趨勢（P＜0.05），這可能是因為隨NaCl濃度升高，蛋白質(zhì)周圍的親水基團逐漸結(jié)合水分子，允許部分疏水性氨基酸殘基包埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，引起表面疏水性下降。當(dāng)NaCl濃度從0.6 mol/L增加至1.0 mol/L時，M組疏水性顯著增加（P＜0.05），而M-RA組無顯著變化（P＞0.05），這可能是因為肌球蛋白在高鹽濃度下出現(xiàn)鹽析作用導(dǎo)致疏水作用增加，而添加RA可以抑制這種作用。總體而言，添加RA導(dǎo)致肌球蛋白疏水性升高，說明RA可以促進肌球蛋白結(jié)構(gòu)的展開，暴露埋藏在蛋白分子內(nèi)部的疏水性基團。結(jié)合色氨酸熒光結(jié)果，進一步表明添加RA可以促使蛋白結(jié)構(gòu)展開并暴露疏水性基團，從而利于肌球蛋白與RA發(fā)生疏水相互作用。

2.3 總巰基分析

圖3 不同NaCl濃度下RA對肌球蛋白總巰基的影響Fig. 3 Effect of RA on total sulfhydryl content of myosin at different NaCl concentrations

總巰基包括埋藏在蛋白分子內(nèi)部和暴露在蛋白分子表面的巰基，暴露于分子表面的巰基極易被氧化成二硫鍵，引起蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)，進而影響蛋白質(zhì)的功能特性[18]。如圖3所示，當(dāng)NaCl濃度從0.2 mol/L增加至0.4 mol/L時，兩組總巰基含量均顯著增加（P＜0.05）；NaCl濃度在0.4～1.0 mol/L范圍內(nèi)，兩組總巰基含量無顯著變化（P＞0.05），說明此時NaCl濃度對蛋白巰基含量無顯著性影響?？傮w而言，添加RA導(dǎo)致肌球蛋白總巰基含量下降，這可能是因為RA促進蛋白結(jié)構(gòu)展開，埋藏在蛋白分子內(nèi)部的部分巰基暴露出來，進而被氧化為二硫鍵等導(dǎo)致巰基含量降低[19]。此外，巰基的減少還可能是因為酚類化合物與蛋白巰基發(fā)生相互作用。賈娜等[20]將迷迭香提取物添加到肌原纖維蛋白中，迷迭香提取物中的多酚類化合物均含有巰基結(jié)合位點，因而使得巰基含量下降。Tang Changbo等[21]研究發(fā)現(xiàn)高濃度的多酚能與蛋白中的巰基發(fā)生共價結(jié)合，生成巰基-醌加成物。

圖4 不同NaCl濃度下RA對肌球蛋白SDS-PAGE的影響Fig. 4 Effect of RA on SDS-PAGE pattern of myosin at different NaCl concentrations

為了進一步驗證溶液體系中RA與巰基是否發(fā)生了相互作用，分析RA對肌球蛋白SDS-PAGE圖譜的影響。如圖4所示，肌球蛋白由大約200 kDa的肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）亞基譜帶和分子質(zhì)量大約15～25 kDa的3 條肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）亞基，以及43 kDa的肌動蛋白雜條帶組成。在SDS-PAGE中，非還原條件下（-β-ME），隨NaCl濃度的增加，兩組蛋白分子組成無明顯區(qū)別，在濃縮膠頂部均存在高分子聚合物。在還原條件下（+β-ME），這些聚合物得到分解，說明聚合物主要是通過二硫鍵交聯(lián)產(chǎn)生。此外，MHC帶處濃度明顯減少，說明非還原條件下，該條帶并非單純的MHC組分，還包含了部分由二硫鍵交聯(lián)形成的聚合物。與M組相比，還原和非還原條件下M-RA組圖譜均無明顯變化，也就是說所有聚合物是通過二硫鍵交聯(lián)而非RA導(dǎo)致的共價交聯(lián)所產(chǎn)生，說明肌球蛋白與RA之間作用以非共價作用為主，故在電泳條件下，SDS溶液可以破壞這些弱鍵，使得圖譜沒有明顯差異。

2.4 圓二色譜分析

圖5 不同NaCl濃度下RA對肌球蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Fig. 5 Effect of RA on secondary structures of myosin at different NaCl concentrations

如圖5所示，兩組肌球蛋白在208 nm和222 nm波長附近均出現(xiàn)2 個強負(fù)吸收峰，表明螺旋結(jié)構(gòu)的存在并作為二級結(jié)構(gòu)的主要部分，隨NaCl濃度增加，兩組α-螺旋結(jié)構(gòu)含量顯著增加（P＜0.05），這可能是因為α-螺旋結(jié)構(gòu)是由蛋白質(zhì)的羰基（—CO）和氨基（NH—）之間的氫鍵所維持的，高離子強度下受靜電屏蔽作用更有利于氫鍵的形成和穩(wěn)定。

總體而言，添加RA后，肌球蛋白的α-螺旋含量降低，說明RA可以促進肌球蛋白雙螺旋桿狀尾部結(jié)構(gòu)的解旋，導(dǎo)致肌球蛋白結(jié)構(gòu)進一步得到展開，這與表面疏水性結(jié)果一致。此外，RA的羥基可與蛋白質(zhì)多肽鏈的羰基形成氫鍵，這可能會破壞肌球蛋白分子內(nèi)氫鍵平衡，從而破壞其穩(wěn)定性。

2.5 肌球蛋白與RA的互作機制

如圖6所示，在溶液中，肌球蛋白與RA之間主要通過疏水相互作用結(jié)合，不存在共價相互作用，添加RA可以促進肌球蛋白結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的活性基團，進一步利于肌球蛋白與RA之間發(fā)生疏水相互作用。肌球蛋白與RA之間的相互作用除了可以影響蛋白分子的結(jié)構(gòu)特征，還可能會進一步影響其理化特性。

圖6 溶液中肌球蛋白與RA的互作機制Fig. 6 Mechanism underlying interaction between myosin and RA in aqueous solution

2.6 溶解度和濁度分析

如圖7所示，當(dāng)NaCl濃度從0.2 mol/L增加至0.6 mol/L時，兩組的溶解度均呈顯著增加趨勢（P＜0.05），而濁度呈現(xiàn)相反變化趨勢，這是因為在0.2 mol/L NaCl條件下，肌球蛋白分子以不溶性的纖絲形式存在；隨NaCl濃度增加，鹽離子逐漸破壞肌球蛋白分子間靜電相互作用，抑制絲狀體的形成，蛋白分子表現(xiàn)為可溶性單體或寡聚體[22]。當(dāng)NaCl濃度高于0.6 mol/L時，M組溶解度呈現(xiàn)微弱的下降趨勢，這可能是因為分子間的靜電斥力減弱允許蛋白分子相互靠近以致發(fā)生聚集，且由于疏水基團的互作用，導(dǎo)致溶解度下降[20]?？傮w而言，添加RA后，肌球蛋白的溶解度降低，濁度增加，這可能是因為RA促進了肌球蛋白結(jié)構(gòu)展開，疏水性基團得到暴露，并改變了蛋白分子的帶電狀況，導(dǎo)致蛋白聚集，從而改變了肌球蛋白的溶解度和濁度。

2.7 Zeta電位和粒徑分析

圖8 不同NaCl濃度下RA對肌球蛋白粒徑和Zeta電位的影響Fig. 8 Effects of RA on particle size and zeta potential of myosin at different NaCl concentrations

Zeta電位描述了溶液體系中顆粒之間的靜電相互作用，可以表征溶液體系的穩(wěn)定性[23-24]。如圖8所示，Zeta電位為負(fù)值，表明肌球蛋白呈負(fù)電荷。隨著NaCl濃度的增加，肌球蛋白Zeta電位的絕對值降低，這可能是由于鹽離子的引入對蛋白分子表面擴散雙電層產(chǎn)生壓縮作用[25]?？傮w而言，添加RA后，Zeta電位的絕對值明顯降低，這可能是因為肌球蛋白與RA結(jié)合后對電荷產(chǎn)生的的屏蔽作用，導(dǎo)致肌球蛋白表面負(fù)電荷數(shù)量減少，減弱了蛋白分子間的靜電斥力，使得蛋白分子之間傾向于相互聚集[26]。

粒徑反映了溶液體系中粒子的大小與分布，測定蛋白質(zhì)粒徑能直觀地看出蛋白質(zhì)聚集情況[27]。如圖8所示，與肌球蛋白濁度的變化結(jié)果一致，在0.2 mol/L NaCl下，肌球蛋白呈難溶性的細(xì)長絲狀，蛋白分子聚集成團，故粒徑較大；而隨NaCl濃度的升高，聚集的蛋白分子經(jīng)歷先解聚再進一步解離的過程，并以可溶性單體形式存在，粒徑顯著減?。≒＜0.05）?？傮w而言，添加RA后，蛋白粒徑增加，這可能是因為RA促進了肌球蛋白表面疏水性的升高，疏水作用是蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象的主要作用力，這種聚集在一定程度上影響了蛋白質(zhì)分子的粒徑分布。此外，肌球蛋白與RA之間的相互作用對肌球蛋白電荷的屏蔽作用降低了蛋白穩(wěn)定性，也會增大其粒徑。

2.8 乳化特性分析

圖9 不同NaCl濃度下RA對肌球蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig. 9 Effects of RA on EAI and ESI of myosin at different NaCl concentrations

在肉制品加工中，乳化性直接影響乳化肉制品的質(zhì)構(gòu)、黏著性、保油保水性和出品率，并對最終產(chǎn)品的品質(zhì)起決定性作用。如圖9所示，當(dāng)NaCl濃度從0.2 mol/L增加至0.6 mol/L時，兩組乳化活性和乳化穩(wěn)定性均呈顯著增加趨勢（P＜0.05），當(dāng)NaCl濃度高于0.6 mol/L時，兩組乳化性和乳化穩(wěn)定性變化不明顯。溶解度是影響蛋白乳化性的重要因素，吳菊清等[28]研究表明蛋白乳化性與其溶解度呈正相關(guān)，與表面疏水性呈負(fù)相關(guān)。隨NaCl濃度增加，肌球蛋白的溶解度逐漸增大，蛋白能迅速移到油水界面形成界面膜參與乳化，進而提高了乳化活性；溶解度的增加還提高了分布在油水界面的蛋白質(zhì)濃度，蛋白可以更好地包裹在油滴表面，從而增強了乳化穩(wěn)定性。

添加RA后，0.2～0.4 mol/L NaCl條件下，乳化活性和乳化穩(wěn)定性明顯降低，這可能是因為肌球蛋白RA與的相互作用導(dǎo)致肌球蛋白溶解度降低，故乳化能力減弱。0.6～1.0 mol/L NaCl條件下，雖然RA降低了肌球蛋白的溶解度，但乳化性沒有明顯差別，乳化穩(wěn)定性差異也較小，這可能是因為RA的添加改變了體系的親水親油平衡值，使蛋白更容易在油水界面展開，從而彌補了溶解度差異帶來的影響。曹云剛[29]研究發(fā)現(xiàn)低濃度表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）對肌原纖維蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性無明顯影響，但高濃度EGCG顯著降低了肌原纖維蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。故在實際應(yīng)用中，要考慮多酚類化合物或香辛料的種類及其使用量對產(chǎn)品功能性質(zhì)的影響[30]，避免對產(chǎn)品品質(zhì)產(chǎn)生不良影響。

3 結(jié) 論

本研究分析了溶液狀態(tài)下肌球蛋白與RA之間的相互作用。色氨酸熒光結(jié)果表明，RA對肌球蛋白的內(nèi)源熒光具有較強的靜態(tài)猝滅作用，且RA與肌球蛋白主要通過疏水相互作用自發(fā)進行結(jié)合?？値€基和電泳結(jié)果表明，肌球蛋白與RA之間不存在共價交聯(lián)。表面疏水性和圓二色譜結(jié)果表明，添加RA可以促進肌球蛋白結(jié)構(gòu)展開，α-螺旋含量降低，更多活性基團暴露，表面疏水性增加。不同NaCl條件下，添加RA會降低Zeta電位的絕對值，導(dǎo)致肌球蛋白的溶解度降低，濁度和粒徑增大。低鹽濃度下（0.2～0.4 mol/L），添加RA降低了肌球蛋白的乳化性，中高鹽濃度時（0.6～1.0 mol/L）時，RA對肌球蛋白的乳化性影響較小。