丁 旭，郭佳琦，張嘉琪，解宇浩，徐連秀，狄文慧，聶文營(yíng)，郝 峰

(吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)教研室，吉林 吉林 132013)

目的基因?qū)氩⒈磉_(dá)于真核細(xì)胞是確定目的基因生物學(xué)活性的必要方法之一，目前常用的目的基因?qū)敕椒ㄓ须姶┛?、病毒介?dǎo)轉(zhuǎn)染和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等[1]。其中，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染因操作簡(jiǎn)單且不需要特殊儀器設(shè)備而被廣泛接受[2]。轉(zhuǎn)染時(shí)，不管實(shí)際使用的目的基因如何，轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)給出的方法都是相同的。但是實(shí)際操作時(shí)，不同的目的基因轉(zhuǎn)染時(shí)的效率不同,而轉(zhuǎn)染效率越高，后續(xù)獲得陽(yáng)性克隆的概率越大。因此，本實(shí)驗(yàn)研究使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時(shí)目的基因大小對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響，從而為后續(xù)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)提供改進(jìn)措施。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

真核表達(dá)載體ANO1-EGFP/pcDNA3.1和YFP/pcDNA3.1由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并完成轉(zhuǎn)化;所用引物由南京諾唯贊公司合成;Lipofectamine 3000脂質(zhì)體購(gòu)自Invitrogen公司;質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京全式金公司;F-12Ham’s營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司;血清購(gòu)自GEMINI公司;FRT細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

Accuri C6(美國(guó)BD)；倒置熒光顯微鏡(日本Nikon)；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo)；超純水機(jī)(美國(guó)Millipore)；凝膠成像儀(美國(guó)Biorad)；Nanodrop 2000(美國(guó)Thermo)。

1.2 質(zhì)粒提取與質(zhì)量檢測(cè)

取已轉(zhuǎn)化完成的大腸桿菌接入50 mL的2×YT培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)，按照質(zhì)粒小提取試劑盒說(shuō)明書(shū)裂解細(xì)菌提取質(zhì)粒。提取完成后，用Nanodrop 2000檢測(cè)質(zhì)粒的濃度和純度，按照Lipofectamine 3000試劑要求，取濃度在500～5000 mg/L的質(zhì)粒備用。

1.3 轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

轉(zhuǎn)染使用細(xì)胞為FRT細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前12 h消化細(xì)胞至24孔板，保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到70%～90%。消化后細(xì)胞分為兩組，每組4個(gè)孔，一組轉(zhuǎn)染YFP/pcDNA3.1，另一組轉(zhuǎn)染ANO1-EGFP/pcDNA 3.1。脂質(zhì)體每個(gè)孔用量按梯度設(shè)置為3、4、5、6 μL，兩種質(zhì)粒每個(gè)孔的用量均為1.5 μg。按照說(shuō)明書(shū)混合完轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒后，室溫孵育20 min。孵育時(shí)用PBS溶液清洗細(xì)胞，去除殘留的血清。清洗完成后，每個(gè)孔中加入450 μL F12完全培養(yǎng)液。脂質(zhì)體-質(zhì)?；旌先芤悍跤瓿珊?，向每個(gè)孔逐滴加入50 μL混合溶液，搖勻后放入CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育48 h。48 h后檢測(cè)細(xì)胞是否表達(dá)目的基因，先在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞表達(dá)熒光情況，充分消化細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞總數(shù)的比值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒提質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

質(zhì)粒使用Nanodrop 2000(美國(guó)Thermo)進(jìn)行檢測(cè)，質(zhì)粒在260 nm處有最高峰，YFP/pcDNA3.1濃度為1 853.4 mg/L,A260/A280為1.84，A260/A230為2.04；ANO1-EGFP/pcDNA3.1濃度為1 103.1 mg/L,A260/A280為1.84，A260/A230為2.01。OD260/OD280=1.8～2.0時(shí)，即可說(shuō)明無(wú)蛋白質(zhì)污染，OD260/OD230=2.0～2.2時(shí)，即可說(shuō)明無(wú)醇和鹽的殘留，則ANO1-EGFP/pcDNA3.1和YFP/pcDNA3.1均可認(rèn)為是純品且濃度符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 倒置熒光顯微鏡觀測(cè)轉(zhuǎn)染結(jié)果

轉(zhuǎn)染48 h后用熒光顯微鏡觀察，可見(jiàn)轉(zhuǎn)染了ANO1的部分FRT細(xì)胞膜上有綠色熒光，見(jiàn)圖1a，轉(zhuǎn)染了YFP的部分FRT細(xì)胞漿中表達(dá)綠色熒光，見(jiàn)圖1b。結(jié)果表明，兩種真核表達(dá)載體均轉(zhuǎn)染成功。

a.ANO1在FRT中的表達(dá);b.YFP在FRT細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率

熒光顯微鏡初步判斷轉(zhuǎn)染是否成功及對(duì)比轉(zhuǎn)染效率后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用空白組(未轉(zhuǎn)染的FRT細(xì)胞)設(shè)門，清空背景和碎片干擾，并確定未轉(zhuǎn)染細(xì)胞本底表達(dá)熒光的發(fā)射光范圍。再分別對(duì)三次轉(zhuǎn)染結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，YFP和ANO1-GFP在質(zhì)粒用量為1.5 μg脂質(zhì)體用量為3、4、5、6 μL時(shí)，轉(zhuǎn)染效率依次上升；每一個(gè)濃度梯度，YFP的轉(zhuǎn)染效率均大于ANO1-GFP的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果見(jiàn)圖2。

三次檢測(cè)結(jié)果取算數(shù)平均數(shù)，YFP在質(zhì)粒用量為1.5 μg脂質(zhì)體用量為3、4、5、6 μL時(shí)，轉(zhuǎn)染效率分別為9.0%、9.7%、11.2%、11.8%;ANO1在質(zhì)粒用量為1.5 μg脂質(zhì)體用量為3、4、5、6 μL時(shí)，轉(zhuǎn)染效率分別為7.6%、8.7%、9.3%、10.8%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。證實(shí)脂質(zhì)體用量越大，轉(zhuǎn)染效率越高，且目的基因大小影響用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時(shí)的效率，目的基因越大，轉(zhuǎn)染效率越低。

3 討 論

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染因操作簡(jiǎn)單且不需要特殊儀器設(shè)備而被廣泛接受[3]，目的基因的大小被認(rèn)為對(duì)轉(zhuǎn)染效率有較明顯的影響[4]。轉(zhuǎn)染時(shí)，不管實(shí)際使用的載體如何，轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)給出的方法都是相同的，但是實(shí)際操作時(shí)，不同的目的基因轉(zhuǎn)染時(shí)的效率不同。而轉(zhuǎn)染效率越高，后續(xù)獲得陽(yáng)性克隆的概率越大。本研究選用連接在相同載體上啟動(dòng)子相同而目的基因大小不等的兩種真核表達(dá)載體ANO1-EGFP/pcDNA3.1和YFP/pcDNA3.1，梯度設(shè)置脂質(zhì)體用量，選取易于轉(zhuǎn)染的FRT細(xì)胞進(jìn)行研究。ANO1-EGFP/pcDNA3.1和YFP/pcDNA3.1均表達(dá)熒光，便于實(shí)驗(yàn)的觀察和檢測(cè)。構(gòu)建的載體中，ANO1大小為2871 bp,EGFP大小為720 bp，YFP大小為720 bp[5-6]，可以知道ANO1-EGFP大小顯著大于YFP，在相同實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)得YFP的轉(zhuǎn)染效率高于ANO1-EGFP的轉(zhuǎn)染效率。因此，本研究證實(shí)，無(wú)論脂質(zhì)體用量如何，目的基因大小影響用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時(shí)的效率，且目的基因越大，轉(zhuǎn)染效率越低。研究結(jié)果對(duì)于今后脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染工作具有指導(dǎo)作用，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)并沒(méi)有考慮到目的基因的大小，而不同大小的目的基因使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時(shí)結(jié)果差異較大。而轉(zhuǎn)染效率越高，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也會(huì)更好[7]，并且瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率越高，后續(xù)篩選時(shí)獲得陽(yáng)性克隆的概率越大。所以在不損傷細(xì)胞的情況下，目的基因較大時(shí)，脂質(zhì)體用量可以適當(dāng)增加。后續(xù)研究可以針對(duì)不同的細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是否有影響，以及確定多大量的脂質(zhì)體會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。