熊 文, 魏 文

(1.湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院， 湖北 恩施 445000 2.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 湖北 武漢 430056)

隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展及國民生活方式的深刻變化，我國心腦血管疾病的發(fā)病人數(shù)也持續(xù)增加[1]。雖然近年來血管介入技術(shù)在心腦血管疾病治療中的普及挽救了大量患者的生命，但介入術(shù)后的血管再狹窄問題也一直影響著患者術(shù)后療效[2]。眾所周知，血管平滑肌細(xì)胞的過度增殖以及局部炎癥反應(yīng)的激活是導(dǎo)致血管再狹窄的重要原因。大蒜素是從大蒜中提取的活性成分，具有多種生物學(xué)活性。研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，且發(fā)揮作用與其影響炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[3]。同時大蒜素對血管平滑肌細(xì)胞鈣電流具有一定的影響，但目前為止關(guān)于大蒜素對血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究卻少有報道。因此，本研究通過體外培養(yǎng)VSMCs，并使用血小板衍生生長因子BB(PDGF-BB)刺激VSMCs增殖，觀察了大蒜素對VSMCs增殖的作用以及對NF-κB信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響，從而為血管再狹窄治療尋找潛在的藥物。

1 材料與方法

1.1材料:SD雄性大鼠(120～150g)，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。大蒜素購自美國Sigma生物公司；血小板衍生生長因子BB(PDGF-BB)購自美國R&D公司；DMEM/F12培養(yǎng)基及1×磷酸鹽緩沖液均購自美國HyClone公司；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司；CCK-8細(xì)胞毒性及增殖檢測試劑盒(CCK-8)購自日本同仁化學(xué)研究所；BCA蛋白濃度檢測試劑盒、脂多糖(LPS)、辣根過氧化物酶(HRP)抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)均購自上海碧云天生物公司；核轉(zhuǎn)錄因子κB p65(NF-κB p65)及磷酸化NF-κB p65(P-p65)一抗均購自美國CST公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.2方 法

1.2.1大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定:根據(jù)文獻(xiàn)[4]中所述，獲取并培養(yǎng)大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞，用大鼠α-SM-actin抗體進(jìn)行免疫熒光染色鑒定VSMCs。將細(xì)胞純度達(dá)到95%以上的第3～5代血管平滑肌細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2實驗分組:將實驗共分為4組：對照組(A組)、PDGF-BB刺激組(B組)、PDGF-BB+大蒜素處理組(C組)、PDGF-BB+大蒜素+脂多糖處理組(D組)。

1.2.3CCK-8實驗:根據(jù)文獻(xiàn)[5]中所述，步驟如下：①細(xì)胞活性檢測：將血管平滑肌細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來后，以2.0×104個/孔接種在96孔板中。培養(yǎng)24h后待細(xì)胞生長融合至底壁80%時，將培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓處理24h，然后再將細(xì)胞與含不同濃度(4,8,16,32,64和128μmoL/L)的大蒜素素或0.1%的DMSO的培養(yǎng)基共孵育24h，向每孔加入10μL CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2h后，在酶標(biāo)儀上(450nm)測各孔的光密度(OD)值。②細(xì)胞增殖檢測：將4組細(xì)胞按2.0×104個/孔接種于96孔板中，待血管平滑肌細(xì)胞融合至培養(yǎng)板底壁50%～60%，將培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基饑餓處理24h后，然后向A組中加入含1%FBS的培養(yǎng)基，其余3組在加入1%FBS的基礎(chǔ)上，分別向B組中加入PDF-BB刺激、向C組中加入PDGF-BB和大蒜素刺激、向D組中加入PDGF-BB和大蒜素及脂多糖刺激，24h后向每孔加入10uL CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2h后，在酶標(biāo)儀上(450nm)測各孔的OD值。每組設(shè)6個復(fù)孔。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期:將細(xì)胞接種于6cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合至60%左右時，饑餓處理24h。后將各組培養(yǎng)基更換為含PDGF-BB和/或相應(yīng)濃度大蒜素及脂多糖的1% FBS的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。接著用胰酶將細(xì)胞消化下來并在水平離心機(jī)中以1000轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速離心，然后使用預(yù)冷的PBS將細(xì)胞洗滌2次后，在渦旋儀上邊渦旋邊加入預(yù)冷的70%的乙醇固定細(xì)胞，然后放置4℃過夜。取出細(xì)胞離心并用PBS洗滌細(xì)胞2次，然后加入0.4mL PI稀釋液(含50mg/L的PI和100mg/L的RNase A)室溫避光孵育30min，然后使用流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson, USA)檢測各組細(xì)胞周期分布情況，實驗重復(fù)3次。計算S期分?jǐn)?shù)和細(xì)胞增殖指數(shù)。S期分?jǐn)?shù)(SPF)=S/(G0/G1+S+G2/M)×100%。細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.2.5蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測蛋白表達(dá):各組細(xì)胞按條件培養(yǎng)完成后，棄去培養(yǎng)上清液后，使用預(yù)冷的PBS清洗3遍，然后使用預(yù)冷細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞以獲得蛋白，然后通過BCA蛋白濃度測定試劑盒根據(jù)說明書操作測定各組蛋白濃度，然后向各組蛋白中加入上樣緩沖液煮沸后備用。然后將蛋白加入10%的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。電泳完成后進(jìn)行電轉(zhuǎn)并進(jìn)行封閉。然后根據(jù)指示條帶將目的條帶裁剪后分別與對應(yīng)的一抗(NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65、GAPDH)于4℃水平搖床中孵育18h以上。然后將不同分子蛋白條帶取出后放入PBST中在水平搖床上洗滌3次，每次5min，然后將條帶與HRP二抗室溫孵育1～2h。取出條帶放入PBST中在水平搖床上洗滌3次，每次5min，然后將蛋白面朝上放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，打開Image Lab成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國)拍取圖像，通過軟件測定各種目的蛋白條帶灰度值及對應(yīng)的內(nèi)參GAPDH的灰度值，然后進(jìn)行半定量分析。

1.2.6ELISA法測定培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β含量:各組細(xì)胞經(jīng)PDGF-BB和/或大蒜素及脂多糖處理24h后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液后離心去除細(xì)胞碎片，按照ELISA試劑盒說明書操作，計算出樣品中對應(yīng)的濃度。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1大蒜素對VSMCs活性的影響:CCK-8結(jié)果(圖1)顯示，大蒜素濃度高于或等于64μmoL/L時，大蒜素可顯著抑制VSMCs活性(P<0.05)；而當(dāng)大蒜素濃度低于64μmoL/L后，大蒜素對VSMCs活性無明顯影響(P>0.05)，故本實驗選取的大蒜素濃度為32μmoL/L。

表1 各組血管平滑肌細(xì)胞S期分?jǐn)?shù)和細(xì)胞增殖指數(shù)

注：與A組比較，*P<0.01；與B組比較，#P<0.01；與C組比較，&P<0.05；n=3

圖1 大蒜素對大鼠血管平滑肌細(xì)胞活性的影響

注：與DMSO組比較，**P<0.01；n=6

2.2大蒜素對VSMCs增殖的影響:CCK-8實驗檢測各組細(xì)胞增殖情況(圖2)顯示，與A組比較，B組VSMCs增殖活性增強(qiáng)1.25倍；與B組比較C組VSMCs增殖活性降低47.75%；而與C組比較，D組VSMCs增殖活性增強(qiáng)38.01%(P均<0.05)。

圖2 大蒜素對大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

注：與A組比較，**P<0.01；與B組比較，##P<0.01；與C組比較，&&P<0.01；n=6

流式細(xì)胞周期檢測結(jié)果如表1所示，與A組比較，B組細(xì)胞經(jīng)PDGF-BB刺激后S期分?jǐn)?shù)和細(xì)胞增殖指數(shù)分別升高1.37倍和0.98倍(P均<0.05)，提示PDGF-BB刺激后細(xì)胞周期進(jìn)展加快，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。然而與B組比較，C組加入大蒜素處理后，S期分?jǐn)?shù)和細(xì)胞增殖指數(shù)分別降低44.1%和44.2%(P均<0.05)，表明細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞增殖能力減弱。而與C組比較，D組加入脂多糖刺激后，S期分?jǐn)?shù)和細(xì)胞增殖指數(shù)分別升高56.7%和52.0%(P均<0.05)，細(xì)胞周期進(jìn)展較C組加快，細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)。

2.3大蒜素抑制VSMCs中P-p65表達(dá):Western blot結(jié)果顯示(圖3)，與A組比較，B組磷酸化p65與總的p65比值(P-p65/p65)提高2.79倍(P<0.05)；而與B組比較，C組P-p65/p65顯著降低近58.0%(P<0.05)。與C組比較，D組P-p65/p65增加64.8%(P<0.05)。另外，各組間總的NF-κB p65水平未見統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

圖3 大蒜素對血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子κB p65的影響

注：與A組比較，**P<0.01；與B組比較，##P<0.01；與C組比較，&P<0.05；n=3

2.4大蒜素抑制VSMCs中TNF-α、IL-1β表達(dá) ELISA結(jié)果(圖4)顯示，與A組比較，PDGF-BB刺激后培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β濃度分別增加1.80倍和2.75倍(P均<0.05)；而與B組比較，C組培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β濃度分別降低44.4%和45.8%(P均<0.05)。另外，與C組比較，D組培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β濃度分別增加28.1%和39.9%(P均<0.05)。以上結(jié)果提示，大蒜素可抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)因子的表達(dá)。

圖4 大蒜素對血管平滑肌細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β表達(dá)的影響

注：與A組比較，**P<0.01；與B組比較，#P<0.05，##P<0.01；與C組比較，&P<0.05；n=3

3 討 論

VSMCs過度增殖是引起血管再狹窄發(fā)生的重要原因之一?；谘艹尚涡g(shù)以及支架植入術(shù)在內(nèi)的介入操作及原發(fā)疾病引起的血管內(nèi)膜損傷，可引起血液中白細(xì)胞、血小板及脂質(zhì)顆粒等聚集并產(chǎn)生炎癥反應(yīng)；與此同時，聚集的血小板、炎癥細(xì)胞等分泌細(xì)胞生長因子和炎癥因子等介質(zhì)，而這些介質(zhì)可誘導(dǎo)VSMCs由靜止的收縮型向活躍的合成型轉(zhuǎn)變，從而引起血管內(nèi)膜過度增殖并遷移至內(nèi)膜，最終導(dǎo)致血管狹窄的發(fā)生。由此可見，對血管內(nèi)膜過度增殖及炎癥反應(yīng)進(jìn)行干預(yù)，可有效減少血管再狹窄的發(fā)生。

大蒜素是大蒜的主要活性物質(zhì)，具有抗氧化，抗腫瘤及防治心肌纖維化等多種功效。在阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心臟毒性模型中，大蒜素可抑制NF-κB蛋白表達(dá)或核轉(zhuǎn)位，并降低大鼠血清中炎癥因子(包括IL-1β和TNF-α)水平顯示出抗炎作用[6]。研究表明，包括IL-1β和TNF-α等在內(nèi)的炎癥因子對VSMCs增殖具有促進(jìn)作用；抑制NF-κB信號通路激活，可通過降低下游炎癥因子的表達(dá)而對血管平滑肌細(xì)胞增殖起到抑制作用，從而減少血管損傷后新生內(nèi)膜的形成[7]。最新研究也顯示，LPS作為NF-κB信號通路的一種激活劑，它可通過誘導(dǎo)NF-κB信號通路的激活對血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移起到促進(jìn)作用[8]。與之前研究相似，本研究中發(fā)現(xiàn)大蒜素可顯著抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs增殖。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可明顯抑制VSMCs內(nèi)NF-κB p65蛋白的磷酸化，以及降低了NF-κB信號通路下游的包括TNF-α、IL-1β在內(nèi)的炎癥因子的水平；而加用NF-κB信號通路激活劑LPS刺激后，可削弱大蒜素抑制VSMCs增殖的能力，同時NF-κB p65蛋白的磷酸化水平、IL-1β、TNF-α濃度均有所上升。

PDGF-BB是一種重要的促有絲分裂因子，可以通過激活細(xì)胞內(nèi)多種信號通路促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖。有研究顯示，PDGF-BB在血管損傷后的新生血管內(nèi)膜增生中具有促進(jìn)作用，其可誘導(dǎo)VSMCs增殖并向內(nèi)膜遷移[9]。因此，PDGF-BB常被用來作為細(xì)胞增殖模型的誘導(dǎo)劑使用。我們的數(shù)據(jù)也顯示，體外培養(yǎng)的VMSCs經(jīng)PDGF-BB刺激后，其增殖能力顯著增強(qiáng)。LPS可作為NF-κB信號通路的激活劑，其可通過增強(qiáng)NF-κB信號通路的激活，增強(qiáng)炎癥因子表達(dá)，本實驗顯示其可削弱大蒜素抑制VSMCs增殖的能力，這為進(jìn)一步確定大蒜素發(fā)揮作用的機(jī)制與其抑制NF-κB信號通路之間的關(guān)系提供了可靠的依據(jù)。

總之，我們的實驗結(jié)果表明，大蒜素可顯著抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖，而發(fā)揮作用的機(jī)制與抑制NF-κB信號通路激活及減弱炎癥反應(yīng)有關(guān)。