羅鈺填， 呂常艷， 謝嶷松， 劉雪燕

(廣東省深圳市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科， 廣東 深圳 518000)

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii，AB)是主要的醫(yī)院感染病原菌之一，近年來AB是導(dǎo)致重癥監(jiān)護(hù)病房(Intensive Care Unit，ICU)呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎(Ventilator-associated Pneumonia，VAP)死亡率升高的主要原因之一，且預(yù)后差[1]。及早發(fā)現(xiàn)影響AB所致VAP預(yù)后的因子對于疾病預(yù)后判斷有重要意義。白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-17在VAP中水平升高可對VAP具有一定診斷價(jià)值[2]，而IL-17可調(diào)控相關(guān)免疫因子水平從而發(fā)揮作用。IL-35可調(diào)控T細(xì)胞相關(guān)亞群從而影響VAP的發(fā)展[3]。尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于IL-17、IL-35在AB所致VAP患者預(yù)后判斷的相關(guān)研究?；诖?，本文通過檢測AB所致VAP不同預(yù)后患者血清中IL-17、IL-35的表達(dá)情況，分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料:深圳市人民醫(yī)院2016年7月至2018年10月127例AB所致VAP患者為研究對象，患者生存和死亡根據(jù)已確診為AB所致VAP為始，連續(xù)30d為限，30d時(shí)患者生存即為生存組，30d內(nèi)患者死亡即為死亡組。84例患者生存(生存組)，男56例、女28例，年齡24～56歲，平均年齡(39.17±8.46)歲；43例患者死亡(死亡組)，男29例、女14例，年齡24～55歲，平均年齡(38.73±6.57)歲，兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性?；颊叻稀逗粑鼨C(jī)相關(guān)性肺炎診斷、預(yù)防和治療指南(2013)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)；②患者均進(jìn)行氣管切開手術(shù)，且手術(shù)器皿等手術(shù)條件均相同，術(shù)后均用呼吸機(jī)輔助呼吸；③患者術(shù)前檢測均未發(fā)現(xiàn)氣管、肺等相關(guān)感染；④患者術(shù)后均出現(xiàn)昏迷狀況；⑤患者均根據(jù)醫(yī)囑咐，根據(jù)自身情況使用抗菌藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：①聯(lián)合感染所致VAP患者；②非首次VAP患者；③有抗菌藥物過敏史患者；④病例資料不完整患者。本研究經(jīng)患者家屬知情并同意，經(jīng)本醫(yī)院倫理協(xié)會(huì)審核并通過。收集兩組一般資料，包括性別、年齡、氣管切開手術(shù)時(shí)間、切口大小、術(shù)中出血量，急性生理學(xué)與慢性健康狀況評分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation，APACHEⅡ)，其中APACHEⅡ評分[5]包括急性生理學(xué)評分、年齡評分、慢性健康狀況評分3部分，最后三項(xiàng)紙盒總計(jì)71分，分值越高病情越重。

1.2主要試劑與儀器:人IL-17酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(美國abcam公司，貨號：ab119535)，人IL-35 ELISA試劑盒(中國臺(tái)灣arigo，貨號：ARG81146)，CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP混合單克隆熒光抗體試劑盒(美國BD公司，貨號：20163402070)，酶標(biāo)儀(賽默飛，型號：Multiskan GO)，流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特，型號：CytoFLEX)。

1.3方 法

1.3.1樣品采集及保存:血清樣品采集：AB所致VAP患者均為確診翌日清晨空腹采集靜脈血5mL，部分室溫自然凝固，血樣3000r/min離心10min，收集上清后分裝做ELISA檢測；1.0mL添加抗凝劑檢測T淋巴細(xì)胞亞群水平。

1.3.2ELISA法檢測血清中IL-17、IL-35表達(dá)水平:按照人ELISA試劑盒說明書檢測IL-17、IL-35和標(biāo)準(zhǔn)品，待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品置于96孔板中，待測樣品6個(gè)重復(fù)，標(biāo)準(zhǔn)品3個(gè)重復(fù)，在450nm波長處測定各孔的OD值。在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、對應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算血清中IL-17、IL-35水平。若待測樣品OD值超過標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，則適當(dāng)稀釋后重測，計(jì)算濃度=曲線方程計(jì)算濃度×稀釋倍數(shù)。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測T淋巴細(xì)胞亞群水平:流式細(xì)胞術(shù)檢測靜脈血中CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞，流式專用管中每管取50μL，添加CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP混合單克隆熒光抗體，震蕩混勻后避光15min，添加紅細(xì)胞裂解液，混勻避光10min，洗滌后流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，計(jì)算CD3+T、CD4+T、CD8+T比例，并求CD4+/CD8+比值。

2 結(jié) 果

2.1兩組一般資料、APACHEⅡ評分比較:兩組性別、年齡、氣管切開手術(shù)時(shí)間、切口大小、術(shù)中出血量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與生存組相比，死亡組APACHEⅡ評分升高(P<0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2兩組血清中IL-17、IL-35水平比較:與生存組相比，死亡組血清中IL-17、IL-35水平升高(P<0.05)，見表2。

2.3兩組T淋巴細(xì)胞亞群水平比較:與生存組相比，死亡組中CD3+T、CD4+T淋巴細(xì)胞水平、CD4+/CD8+比值降低(P<0.05)，CD8+T淋巴細(xì)胞水平升高(P<0.05)，見表3。

表2 兩組血清中IL-17 IL-35水平比較

表3 兩組T淋巴細(xì)胞亞群水平比較

2.4AB所致VAP患者血清中IL-17、IL-35與T淋巴細(xì)胞亞群、APACHEⅡ評分關(guān)系:Pearson法分析AB所致VAP患者血清中IL-17、IL-35與CD3+T、CD4+T、CD4+/CD8+均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與CD8+T、APACHEⅡ評分均呈正相關(guān)(P<0.05),見表4。

2.5影響AB所致VAP患者預(yù)后的因素分析:將AB所致VAP預(yù)后是否良好為因變量，以IL-17、IL-35、CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+、APACHEⅡ評分為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示IL-17、IL-35、APACHEⅡ評分是AB所致VAP預(yù)后的危險(xiǎn)因素，CD4+/CD8+是AB所致VAP預(yù)后的保護(hù)因素，見表5。

表4 AB所致VAP患者血清中IL-17 IL-35與T淋巴細(xì)胞亞群 APACHEⅡ評分關(guān)系

表5 影響AB所致VAP預(yù)后的多因素分析

3 討 論

VAP是ICU患者常見并發(fā)癥，是導(dǎo)致ICU患者死亡的常見原因之一，是重癥監(jiān)護(hù)醫(yī)師的主要挑戰(zhàn)[6]。預(yù)防VAP可減少ICU住院時(shí)間，提高患者生存率，AB感染在VAP患者中發(fā)生比例逐年上升，且病死率高[7]，及早發(fā)現(xiàn)AB所致VAP并盡早治療，對于改善ICU預(yù)后可能有重要意義。AB可改變患者免疫狀態(tài)，腦血管基礎(chǔ)疾病患者中AB為VAP的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[8]。APACHEⅡ評分顯示疾病嚴(yán)重程度，在AB所致VAP死亡患者中APACHEⅡ評分相較與生存組升高，提示疾病加重導(dǎo)致患者死亡。免疫功能紊亂及炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致AB感染后VAP發(fā)生、進(jìn)展的重要因素。T細(xì)胞亞群參與免疫性疾病中細(xì)胞免疫應(yīng)答，CD3+T代表成熟活化T淋巴細(xì)胞水平，可進(jìn)一步分化為輔助T淋巴細(xì)胞CD4+T和毒性T淋巴細(xì)胞CD8+T，CD4+/CD8+比例降低反映機(jī)體免疫功能下降[9]。IL-17屬T細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)早期啟動(dòng)因子，與免疫紊亂及炎癥密切相關(guān)[10]；IL-35被稱為免疫抑制因子，其水平升高可抑制T細(xì)胞增殖并抑制輔助T細(xì)胞Th17細(xì)胞的分化及功能，在免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[11]。IL-35在慢性乙型肝炎病毒感染患者中表達(dá)升高，抑制免疫反應(yīng)，抑制IL-35的表達(dá)可減緩疾病進(jìn)程[12]。IL-17、IL-35在免疫缺陷性病毒感染和混合疾病中表達(dá)異常，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞發(fā)揮作用[13]。在帶狀皰疹和皰疹后神經(jīng)痛患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)與細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化中發(fā)現(xiàn)，患者外周血中IL-17可能與機(jī)體免疫功能相關(guān)，隨著神經(jīng)痛患者疼痛程度變化而變化[14]。

AB感染可引發(fā)VAP患者局部或全身免疫應(yīng)答，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞亞群發(fā)生變化加重疾病進(jìn)程[15]。本研究中，與生存組相比，死亡組中CD3+T、CD4+T淋巴細(xì)胞水平、CD4+/CD8+比值降低，CD8+淋巴細(xì)胞及IL-17、IL-35水平升高，提示AB感染所致VAP患者機(jī)體內(nèi)活化T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，炎癥因子增加，產(chǎn)生的輔助T淋巴細(xì)胞比例降低，毒性T淋巴細(xì)胞比例增加，機(jī)體處于免疫失衡、炎癥反應(yīng)狀態(tài)。本研究中，AB所致VAP患者血清IL-17、IL-35水平與APACHEⅡ評分均呈正相關(guān)，提示IL-17、IL-35與AB所致VAP疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。另外，血清中IL-17、IL-35與CD3+T、CD4+T、CD4+/CD8+均呈負(fù)相關(guān)，與CD8+T呈正相關(guān)，提示AB所致VAP患者血清中IL-17、IL-35與T淋巴細(xì)胞亞群關(guān)系密切，可能影響T淋巴細(xì)胞亞群水平從而影響疾病嚴(yán)重程度。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-17、IL-35、APACHEⅡ評分是影響AB所致VAP預(yù)后的危險(xiǎn)因素，CD4+/CD8+是影響AB所致VAP預(yù)后的保護(hù)因素。IL-17、IL-35、APACHEⅡ評分升高、CD4+/CD8+降低均可增加AB所致VAP患者死亡幾率，在臨床上降低AB所致VAP患者血清中IL-17、IL-35水平可能改善AB所致VAP患者生存情況。

綜上所述，AB所致VAP患者死亡組IL-17、IL-35水平升高，二者與T淋巴細(xì)胞亞群關(guān)系密切，均是影響患者預(yù)后死亡的危險(xiǎn)因素，可能作為指示性因子預(yù)測AB所致VAP患者預(yù)后狀況。但AB所致VAP患者預(yù)后的影響因素較多，可能亦受呼吸機(jī)使用時(shí)間等的影響，且本研究受病例數(shù)限制、納入一般資料有限，進(jìn)一步收集更多患者參與分析是本研究接下來研究的重點(diǎn)，以進(jìn)一步驗(yàn)證本研究。