朱百科， 王新新， 趙 恒

(1.山東省立第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 山東 濟(jì) 南 250031 2.山東省濟(jì)南市第五人民醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腦血管科， 山東 濟(jì) 南 250000 3.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院神經(jīng)外科， 新疆 烏魯木齊 830001)

腦缺血再灌注損傷是腦供血中斷后，重新恢復(fù)大腦供血所引起腦損加重的臨危現(xiàn)象，是患者致殘率和病死率增加的主要原因之一，僅次于癌癥和心臟疾病[1]。因此，發(fā)現(xiàn)減輕腦缺血再灌注損傷的藥物對(duì)于臨床具有重要意義，腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)理較為復(fù)雜，具體機(jī)制依然不太清晰。目前研究表明腦缺血再灌注損傷的機(jī)制可能是由于腦供血中斷后，引起腦組織細(xì)胞缺血、缺氧，誘發(fā)炎癥、神經(jīng)元凋亡及氧化應(yīng)激、自噬等，進(jìn)而導(dǎo)致腦供血恢復(fù)后進(jìn)一步誘發(fā)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及氧化自由基的發(fā)生[2]。因此，抑制炎癥、神經(jīng)元凋亡對(duì)于治療腦缺血再灌注損傷具有重要意義。川芎嗪(Tetramethylpyrazine，TMP)是從川芎根莖中提取的生物堿類化合物，其具有抗血小板聚集、擴(kuò)張血管、降低心肌耗氧、保護(hù)腎臟、抗癲癇等多種作用[3]。同時(shí)，據(jù)研究報(bào)道川芎嗪對(duì)于大鼠心肌缺血再灌注具有一定的保護(hù)作用[4]。但是，川芎嗪對(duì)腦缺血再灌注損傷的作用研究較少，因此，本研究采用大鼠構(gòu)建腦缺血再灌注損傷模型，探討了川芎嗪對(duì)腦缺血再灌注損傷的作用及相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試藥:川芎嗪購自中國藥品生物制品檢定所(批號(hào)：110817-200305)；IL-6、MCP-1、TNF-α ELISA大鼠試劑盒(達(dá)科為，中國)；尼莫地平注射液(山東新華制藥股份有限公司，中國)；抗-VEGF、AKT、p-AKT、PI3K、GAPDH(CST，美國)；RIPA蛋白裂解液(中)、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(碧云天，中國)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IG、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IG(Abcam，英國)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組給藥與模型建立:將220～250g雄性成年SD大鼠(新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)60只隨機(jī)分為假手術(shù)組(C組)、模型組(M組)、川芎嗪低劑量組(L組)、中劑量(I組)、高劑量組(H組)及陽性藥組(P組)，n=10，術(shù)前30min，川芎嗪組大鼠靜脈注射川芎嗪(L組：5mg/kg；I組：10mg/kg；H組：30mg/kg)，假手術(shù)組(C組)和模型組(M組)均給予等體積的生理鹽水，陽性藥組靜脈注射尼莫地平(1.0mg/kg)。采用改進(jìn)的Nagasawa栓線法制備腦缺血再灌注模型，閉塞左側(cè)大腦中動(dòng)脈，造成左側(cè)大腦半球的局灶性腦缺血，缺血1h后，從頸動(dòng)脈抽搐拴線即形成再灌注損傷。

1.3神經(jīng)癥狀評(píng)分:在術(shù)后24h，采用Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)神經(jīng)癥狀，標(biāo)準(zhǔn)：正常，無神經(jīng)損傷癥狀(0分)；不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪(1分)；不能伸展對(duì)側(cè)前爪(2分)；向外側(cè)輕微轉(zhuǎn)圈(3分)；嚴(yán)重轉(zhuǎn)圈(4分)；不能行走(5分)，由不知情的實(shí)驗(yàn)員觀察評(píng)分。

1.4腦梗死體積和含水量檢測(cè):大鼠腦缺血再灌注24后，迅速斷頭取腦，液氮速凍30min，去除嗅球、小腦和低位腦干，腦組織從額極向后做連續(xù)冠狀切成5片，置于37℃，在2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染料中溫育30min，染色結(jié)果為正常組織紅色，梗死組織變白色。去除嗅球、小腦和低位腦干后，稱取大腦濕重量，107℃烘烤72h稱干質(zhì)量，腦含水量=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量*100%。

1.5HE染色:將大鼠深麻醉，然后在缺血再灌注損傷后24h先后用生理鹽水和4%多聚甲醛心臟灌注。將腦取出并在4%多聚甲醛中固定24h，然后石蠟包埋。在切片機(jī)上切成4μm切片，二甲苯脫蠟，酒精脫水。然后，蘇木精染色3min，曙紅染色1min。最后，在光學(xué)顯微鏡下觀察切片，以評(píng)估缺血皮層半影中的腦損傷，石蠟切片用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6尼氏染色:將石蠟切片二甲苯中脫蠟，以70%，75%，90%，95%和100%的乙醇水溶液進(jìn)行脫水。將切片在37℃下用硫氨酸染色1h。在顯微鏡觀察大腦皮層的細(xì)胞形態(tài)，以評(píng)估腦損傷。存活的神經(jīng)元的數(shù)量由觀察者在不了解實(shí)驗(yàn)的情況下進(jìn)行量化。

1.7TUNEL染色:按照標(biāo)準(zhǔn)的組織化學(xué)程序，按照制造商的說明使用原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行TUNEL測(cè)定，以確定大腦皮層中TUNEL陽性細(xì)胞的密度。凋亡指數(shù)(AI)是100個(gè)細(xì)胞核中的細(xì)胞凋亡核數(shù)。AI=(TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.8RT-PCR檢測(cè):分離和收集實(shí)驗(yàn)大鼠的腦組織，稱取約50mg，加入1mLTrizol，組織研磨儀勻漿，提取組織總RNA，用NanoDrop 2000 Spectrophotometer檢測(cè)RNA的濃度和純度，用PrimeScript RT試劑盒和gDNA Eraser(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，日本)將RNA(1 μg)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用配有SYBRs Green Master Mix(諾唯贊，中國)的CFX Connect Real-Time系統(tǒng)(BioRad，美國)進(jìn)行qRT-PCR定量分析，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性15s，60℃延伸30s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，最后根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算IL-6、MCP-1、TNF-α、GAPDH mRNA的表達(dá)水平。TNF-α Forward：5'-GCCTCGTCTCATAGACAAGATGGT-3'；TNF-α Reverse：5'-GAAGGCAGCCCTGGTAACC-3'；IL-6 Forward：5'-CTGCAAGAGACTTCCATCCAG-3'；IL-6 Reverse：AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG-3'；MCP-1 Forward：5'-TCTCGCCCAGGGAGTGCAAAGAGAG-3'；MCP-1 Reverse：TATCGCCAAGGGAACATCTCGAAGCG-3'；GAPDH Forward：5'- GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT - 3'；GAPDH Reverse：5'- GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG - 3'。

1.9ELISA檢測(cè):采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中IL-6、MCP-1、TNF-α的分泌水平，大鼠腹主動(dòng)脈取血，用1.5mL EP管收集血液，室溫靜置30min，3000r/min離心15min，收集上清，根據(jù)制造商的說明采用ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。

1.10蛋白免疫印跡(Western blot):分離收集實(shí)驗(yàn)大鼠的腦組織，稱取約30 mg，加入1mL蛋白裂解液，研磨儀組織勻漿，采用Western Blot檢測(cè)腦組織VEGF、AKT、p-AKT、PI3K蛋白表達(dá)水平。根據(jù)制造商說明操作提取組織總蛋白，采用BCA法(碧云天，中國)進(jìn)行蛋白定量，加入Loading buffer(4X)于100℃煮沸5min，然后采用SDS-PAGE電泳分離蛋白，電泳條件：80V，30min；120V，60min。隨后采用100V，90min將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏佛乙烯(PVDF)膜(Millipore，美國)，用5% BSA室溫封閉60min，TBST洗滌5次，5min/次，用一抗(VEGF、AKT、p-AKT、PI3K及GAPDH，按1∶1000稀釋)4℃孵育過夜，TBST洗滌5次，5min/次，用二抗(HRP標(biāo)記山羊抗兔IG和HRP標(biāo)記山羊抗鼠IG，按1∶10000稀釋)室溫孵育90min，TBST洗滌5次，5min/次，用ECL化學(xué)發(fā)光法(Millipore，MA)顯影檢測(cè)，ImageJ分析灰度值。

2 結(jié) 果

2.1川芎嗪(TMP)對(duì)大鼠神經(jīng)癥狀、腦梗體積及腦含水量的影響:腦梗體積結(jié)果表明與對(duì)照組(C組)相比，模型組(M組)大鼠腦梗死體積顯著增加(P<0.05)，與模型組(M組)相比，術(shù)前靜脈注射川芎嗪能夠顯著降低大鼠腦梗死體積(P<0.05)，見圖1A和B。神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果表明與對(duì)照組(C組)相比，模型組(M組)大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著增加(P<0.05)，與模型組(M組)相比，術(shù)前靜脈注射川芎嗪能夠顯著降低大鼠的神經(jīng)功能缺損(P<0.05)，見圖1C。腦含水量結(jié)果表明與對(duì)照組(C組)相比，模型組(M組)大鼠腦含水量顯著增加(P<0.05)，術(shù)前靜脈注射川芎嗪能夠顯著降低大鼠腦含水量(P<0.05)，見圖1D。

圖1 川芎嗪(TMP)對(duì)大鼠神經(jīng)癥狀、腦梗面積及腦含水量的影響

C：對(duì)照組；M：模型組；L：川芎嗪低劑量組；I：中劑量組；H：高劑量組；P：陽性藥組

A大鼠腦梗體積(紅色：正常組織；白色：梗死組織)；B大鼠腦梗體積半定量統(tǒng)計(jì)；C大鼠神經(jīng)功能評(píng)分；D大鼠腦含水量(與C組相比，###P<0.001；與M組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

2.2川芎嗪(TMP)對(duì)大鼠血清中炎癥因子表達(dá)的影響:采用ELISA檢測(cè)大鼠血清中炎癥因子IL-6、MCP-1、TNF-α表達(dá)水平，結(jié)果表明與對(duì)照組(C組)相比，模型組(M組)大鼠血清IL-6、MCP-1、TNF-α含量顯著增加，術(shù)前靜脈注射川芎嗪能夠顯著降低大鼠血清IL-6、MCP-1、TNF-α含量(P<0.05)，見圖2。

圖2 川芎嗪(TMP)對(duì)大鼠血清炎癥因子含量的影響

C：對(duì)照組；M：模型組；L：川芎嗪低劑量組；I：中劑量組；H：高劑量組；P：陽性藥組

A大鼠血清IL-6水平；B大鼠血清MCP-1水平；C大鼠血清TNF-α水平(與C組相比，###P<0.001；與M組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

2.3川芎嗪(TMP)對(duì)大鼠腦組織病理學(xué)的影響:采用病理學(xué)檢查進(jìn)一步研究了川芎嗪對(duì)腦缺血再灌注損傷的影響，HE結(jié)果表明與對(duì)照組(C組)相比，模型組(M組)大鼠細(xì)胞核濃縮，受損細(xì)胞比例高達(dá)90%，術(shù)前靜脈注射川芎嗪呈劑量依賴性減少腦組織受損細(xì)胞比例，見圖3A和B。尼氏染色結(jié)果表明與對(duì)照組(C組)相比，模型組(M組)神經(jīng)元密度顯著降低，尼氏體水平顯著下降，術(shù)前靜脈注射川芎嗪呈劑量依賴性增加尼氏體數(shù)量，顯著增加神經(jīng)元數(shù)目(P<0.05)，見圖3A和C。TUNEL染色結(jié)果表明與對(duì)照組(C組)相比，模型組(M組)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加，術(shù)前靜脈注射川芎嗪呈劑量依賴性減少凋亡細(xì)胞比例(P<0.05)，見圖3A和D。

圖3 川芎嗪(TMP)對(duì)大鼠腦組織病理學(xué)的影響

C：對(duì)照組；M：模型組；L：川芎嗪低劑量組；I：中劑量組；H：高劑量組；P：陽性藥組

A大鼠腦組織病理學(xué)染色(HE，尼氏和TUNEL染色)；B大鼠腦組織HE染色定量統(tǒng)計(jì)；C大鼠腦組織尼氏染色定量統(tǒng)計(jì)；D大鼠腦組織TUNEL染色定量統(tǒng)計(jì)(與C組相比，###P<0.001；與M組相比，**P<0.01，***P<0.001)

2.4川芎嗪(TMP)對(duì)腦組織炎癥因子表達(dá)的影響:采用RT-PCR法檢測(cè)大鼠腦組織炎癥因子IL-6、MCP-1、TNF-α表達(dá)水平，結(jié)果表明與對(duì)照組(C組)相比，模型組(M組)大鼠腦組織IL-6、MCP-1、TNF-α mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，川芎嗪呈劑量依賴性下調(diào)大鼠腦組織IL-6、MCP-1、TNF-α mRNA表達(dá)水平(P<0.05)，見圖4。

圖4 川芎嗪(TMP)對(duì)大鼠腦組織炎癥因子表達(dá)的影響

C：對(duì)照組；M：模型組；L：川芎嗪低劑量組；I：中劑量組；H：高劑量組；P：陽性藥組

A大鼠腦組織IL-6 mRNA表達(dá)水平；B大鼠腦組織MCP-1 mRNA表達(dá)水平；C大鼠腦組織TNF-α mRNA表達(dá)水平(與C組相比，###P<0.001；與M組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

2.5川芎嗪(TMP)對(duì)腦組織VEGF介導(dǎo)的PI3K-AKT信號(hào)通路活化的影響:采用Western blot法檢測(cè)大鼠腦組織VEGF-PI3K-AKT信號(hào)通路蛋白分子的表達(dá)水平，結(jié)果表明與對(duì)照組(C組)相比，模型組(M組)大鼠腦組織VEGF、PI3K、p-AKT/AKT表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，靜脈注射川芎嗪顯著上調(diào)VEGF、PI3K、p-AKT/AKT的表達(dá)水平(P<0.05)，見圖5。

圖5 川芎嗪(TMP)對(duì)大鼠腦組織VEGF介導(dǎo)的PI3K-AKT信號(hào)通路活化的影響

C：對(duì)照組；M：模型組；H：高劑量組；P：陽性藥組(與M組相比，**P<0.01，***P<0.001)

3 討 論

川芎嗪(TMP)是從傘形科植物川芎根莖中提取的有效生物堿單體成分，其具有活血行氣、化瘀止痛等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有抗血小板聚集、擴(kuò)張小動(dòng)脈、改善循環(huán)、抗氧化、抗纖維化及細(xì)胞凋亡等多種作用。研究表明川芎嗪對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，但是其對(duì)急性腦梗死大鼠缺血再灌注損傷的作用研究較少[4]。因此，本研究采用大鼠腦缺血再灌注模型評(píng)價(jià)了川芎嗪對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及相關(guān)分子機(jī)制。本研究表明與C組相比，M組大鼠出現(xiàn)腦水腫、腦梗死體積增加及神經(jīng)功能癥狀損害嚴(yán)重等癥狀(P<0.05)，預(yù)先靜脈注射川芎嗪(L組，I組，H組)呈劑量依賴性性緩解大鼠腦缺血再灌注引起的腦水腫、腦梗死及神經(jīng)功能損傷等病理癥狀(P<0.05)，且H組的效果與尼莫地平(P組)相當(dāng)(P>0.05)，尼莫地平是本研究使用的陽性對(duì)照藥這表明本研究首先成功建立了腦缺血再灌注損傷大鼠模型，同時(shí)表明川芎嗪對(duì)腦缺血再灌注損傷具有潛在的預(yù)防作用。

腦缺血再灌注損傷的病理機(jī)制復(fù)雜，目前依然不太清晰，研究表明炎癥、凋亡、氧化應(yīng)激等與腦缺血再灌注損傷的病理發(fā)生密切相關(guān)。特別是腦缺血再灌注引起腦水腫的形成可加重神經(jīng)功能的損壞，炎癥在腦缺血后腦水腫形成過程中起著至關(guān)重要的作用[5]。腦缺血過程中會(huì)產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)，如促炎因子或趨化因子等，其抑制或缺乏對(duì)于預(yù)防腦缺血再灌注損傷具有重要意義[6,7]。在本研究結(jié)果表明與C組相比，M組大鼠血清中IL-6、MCP-1、TNF-α的水平顯著上調(diào)(P<0.05)，同時(shí)，與M組相比較，L組，I組，H組大鼠血清中IL-6、MCP-1、TNF-α的水平顯著下調(diào)(P<0.05)，且H組與P組效果相當(dāng)(P>0.05)，上述表明靜脈注射川芎嗪大鼠呈劑量依賴性抑制腦缺血再灌注損傷引起的IL-6、MCP-1、TNF-α產(chǎn)生，其高劑量組與尼莫地平的藥效并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)，川芎嗪對(duì)腦缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)元凋亡具有一定的緩解作用，這表明川芎嗪對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，且這種作用與抗炎和保護(hù)神經(jīng)元相關(guān)。

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，一種內(nèi)皮細(xì)胞強(qiáng)力絲裂劑，能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長，在神經(jīng)保護(hù)作用過程中起著至關(guān)重要的作用[8]。研究表明腦缺血后使用外源性VEGF能夠減少腦梗死體積和改善神經(jīng)功能，并且VEGF能夠促進(jìn)神經(jīng)元生長和內(nèi)皮血管的生成[9,10]。本研究表明與C組相比，M組大鼠腦組織中VEGF蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，與M組相比，H組和P組大鼠腦組織中VEGF蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，同時(shí)H組與P組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，這表明川芎嗪對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能與腦組織VEGF上調(diào)有關(guān)。正磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K)/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(protein-serine-threonine kinase，AKT)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著至關(guān)重要作用，PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)血管生成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和基因表達(dá)具有重要調(diào)節(jié)作用[11]。研究表明VEGF主要通過下游PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化及凋亡過程[12]。因此，本研究推測(cè)川芎嗪能夠活化PI3K/AKT信號(hào)通路減少腦梗死體積及腦水腫，并且促進(jìn)神經(jīng)元生長和抑制神經(jīng)元凋亡，產(chǎn)生保護(hù)作用。同時(shí)，本研究結(jié)果支持了上述觀點(diǎn)，結(jié)果表明與C組相比，M組大鼠腦組織中PI3K、p-AKT/AKT表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但是與M組相比，H組和P組大鼠腦組織中PI3K、p-AKT/AKT表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，這表明靜脈注射川芎嗪能夠促進(jìn)腦組織PI3K、p-AKT/AKT表達(dá)，活化PI3K/AKT信號(hào)通路。

綜上所述，本研究表明川芎嗪對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，并且這種作用可能與激活VEGF介導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。但是，川芎嗪是直接作用于VEGF分子或者間接作用于其他的信號(hào)通路仍然不清楚，尚需進(jìn)一步深入探討。