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        石榴鞣花酸提取物對(duì)人肺癌細(xì)胞A549凋亡的誘導(dǎo)

        2020-07-02 01:39:24趙勝娟劉麗莉程玉江
        關(guān)鍵詞:花酸石榴細(xì)胞周期

        趙勝娟,費(fèi) 鵬,劉麗莉,程玉江

        (1.河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽(yáng) 471023;2.洛寧縣市場(chǎng)監(jiān)督管理局,河南 洛陽(yáng) 471700)

        0 引言

        肺癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一,其治療手段主要有手術(shù)、放療、化療、靶向治療和免疫治療等,但這些治療方式存在較大的毒副作用以及價(jià)格昂貴等問題[1-3]。因此,尋找一種抗癌效果顯著,副作用小且成本低的治療途徑是亟待解決的科學(xué)問題。

        腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖與細(xì)胞的凋亡水平緊密相關(guān),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是防治癌癥的一個(gè)重要策略[4],而天然產(chǎn)物能夠顯著地降低腫瘤細(xì)胞的生命活性[5],因此,越來越多的研究致力于探討不同天然產(chǎn)物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。文獻(xiàn)[6]對(duì)蔥類蔬菜治療癌癥的前景進(jìn)行了綜述。文獻(xiàn)[7]研究了青蒿提取物的抗腫瘤活性,并明確了其有效成分。文獻(xiàn)[8]研究了4種伏牛山原生藥用植物的抗癌活性,發(fā)現(xiàn)其醇提物在體外對(duì)食管癌細(xì)胞或肝癌細(xì)胞具有濃度依賴的生長(zhǎng)抑制作用,以70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇提取物活性最強(qiáng)。石榴具有驅(qū)蟲、抗菌、抗病毒、預(yù)防和治療心腦血管、抗癌等多種藥理作用[9-11],而這些功效都?xì)w結(jié)于石榴中含有豐富多樣的酚類物質(zhì)。鞣花酸(ellagic acid,EA)是石榴中主要的酚類物質(zhì)之一,文獻(xiàn)[12-13]研究了石榴皮多酚提取物和其主要活性物質(zhì)安石榴苷、鞣花酸對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)它們能夠通過線粒體通路干預(yù)細(xì)胞的凋亡,而石榴鞣花酸提取物(ellagic acid extracts from pomegranate,EAEFP)對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用及其可能的作用途徑尚未得到清晰的揭示。

        本文以A549肺癌細(xì)胞為研究對(duì)象,分析EAEFP對(duì)A549肺癌細(xì)胞存活率、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的作用,以期揭示EAEFP誘導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞凋亡的可能作用途徑,為石榴的深度加工利用和新型天然抗腫瘤功能性食品的開發(fā)提供一定的理論參考,對(duì)充分挖掘石榴的食用及保健價(jià)值具有積極意義。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549:河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院細(xì)胞室保存;石榴鞣花酸提取物(EAEFP):西安維特生物科技有限責(zé)任公司提供,由石榴皮(產(chǎn)地:陜西臨潼)用100%(體積分?jǐn)?shù))甲醇提取所得。

        四甲基偶氮唑鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT),4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI):美國(guó)Sigma公司;細(xì)胞培養(yǎng)基:RPMI-1640,美國(guó)Gibco公司;胎牛血清:Gibco 10099-141,美國(guó)Gibco|Life Technologies公司;細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒:Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒,南京建成生物工程研究所。

        1.2 試驗(yàn)儀器

        Agilent 1200 Infinity 系列高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)系統(tǒng):北京安捷倫科技公司;CO2恒溫培養(yǎng)箱:CCL-170B-8型,新加坡ESCO有限公司;普通倒置顯微鏡:OLYMPUS CKX41型,日本OLYMPUS公司;全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀:Multiskan GO型,美國(guó)熱電公司;生物柜:ESCO AC2-4S1型,新加坡 ESCO有限公司;流式細(xì)胞儀:FACSCalibur型,美國(guó)BD公司;熒光倒置顯微鏡:Leica DM3000型,上海徠卡儀器有限公司。

        1.3 試驗(yàn)方法

        1.3.1 石榴鞣花酸提取物HPLC分析

        準(zhǔn)確稱取0.10 g的EAEFP,溶于甲醇中,配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的樣品溶液,用0.22 μm的過濾膜過濾后注入高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行成分分析。液相檢測(cè)條件:色譜柱 Aglient Zorbax SB-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm),紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量20 μL,流動(dòng)相A為1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))冰醋酸,流動(dòng)相B為甲醇,流速1 mL/min。檢測(cè)程序:0~70 min(流動(dòng)相 A:95%~56%(體積分?jǐn)?shù)),流動(dòng)相 B:5%~44%(體積分?jǐn)?shù))),70~80 min(流動(dòng)相A:56%,流動(dòng)相B:44%)[14]。

        1.3.2 石榴鞣花酸提取物溶液配制及細(xì)胞培養(yǎng)

        稱取一定量的EAEFP,用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解,配制成質(zhì)量濃度為15 mg/mL的貯存液,避光保存于4 ℃冰箱中備用。試驗(yàn)時(shí),用無血清培養(yǎng)基把貯存液按2∶3(體積比)稀釋成一系列工作濃度,保證DMSO在終體系中體積分?jǐn)?shù)不大于1‰。A549肺癌細(xì)胞用含10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的RPMI-1640培養(yǎng)液,置于37 ℃,5%(體積分?jǐn)?shù))CO2相對(duì)飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

        1.3.3 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)

        利用MTT比色法檢測(cè)EAEFP對(duì)A549肺癌細(xì)胞存活率的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549肺癌細(xì)胞,計(jì)數(shù)后調(diào)整至適宜種板密度,每孔種板90 μL。過夜培養(yǎng)后,分別加入10 μL不同質(zhì)量濃度的EAEFP。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,每孔加入20 μL MTT,孵育4 h后加入50 μL三聯(lián)液,過夜孵育后用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處的吸光度,以對(duì)照組為100%計(jì)算各處理組的細(xì)胞活力。各質(zhì)量濃度的EAEFP設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔,為了消除原始細(xì)胞對(duì)吸光度的影響,不同處理樣品最后的吸光值均減去原始細(xì)胞的吸光值。

        1.3.4 DAPI染色法分析細(xì)胞形態(tài)

        取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549肺癌細(xì)胞接種于六孔板,種板密度為1×105mL-1,每孔2 mL,將經(jīng)過多聚賴氨酸包被的無菌玻片放入六孔板中。過夜培養(yǎng)后,加EAEFP繼續(xù)孵育48 h,將上清液棄去,加入4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚賴氨酸固定。將固定液去除后,加入DAPI染色液,染色15 min后,用熒光顯微鏡拍照[15]。

        1.3.5 細(xì)胞周期的檢測(cè)

        利用流式分析儀分析EAEFP對(duì)A549肺癌細(xì)胞周期的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549肺癌細(xì)胞接種于六孔板,種板密度為1×105mL-1,每孔2 mL。過夜培養(yǎng)后,加EAEFP繼續(xù)孵育48 h,離心收集細(xì)胞,棄上清液,用預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗細(xì)胞2次。加入預(yù)冷70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇,于4 ℃固定過夜,或-20 ℃長(zhǎng)期固定。離心收集細(xì)胞,以1 mL的PBS洗細(xì)胞1次,加入500 μL PBS(含50 μg/mL碘化丙啶(propidium iodide,PI),100 μg/mL RNase A),4 ℃避光孵育30 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè),一般計(jì)數(shù)1×104個(gè)細(xì)胞,結(jié)果用細(xì)胞周期擬合軟件ModFit進(jìn)行分析。

        1.3.6 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)

        根據(jù)文獻(xiàn)[16]的方法,利用Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞儀,檢測(cè)EAEFP對(duì)A549肺癌細(xì)胞的凋亡。按照試劑盒操作說明進(jìn)行如下操作:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549肺癌細(xì)胞接種于六孔板中,種板密度為1×105mL-1,每孔2 mL。過夜培養(yǎng)后加EAEFP。相同條件下,繼續(xù)孵育48 h,消化收集細(xì)胞,用PBS洗2次,加入100 μL 結(jié)合緩沖液、5 μL異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,F(xiàn)ITC)標(biāo)記的Annexin-V和1 μL PI,室溫避光30 min。加入400 μL緩沖液,立即用FAC Scan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè),以不加Annexin V-FITC及PI作為陰性對(duì)照。

        1.4 數(shù)據(jù)分析

        以上試驗(yàn)每組樣品測(cè)3個(gè)平行樣,所得數(shù)據(jù)用Microsoft Excel數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理、制圖,并用DPS軟件進(jìn)行差異性分析,顯著水平為P<0.05。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 石榴鞣花酸提取物成分鑒定及定量

        在前期的研究中,確定了鞣花酸標(biāo)品HPLC圖譜中最高峰在保留時(shí)間65 min左右出現(xiàn)。進(jìn)而,利用HPLC法分析EAEFP的組成成分,結(jié)果如圖1所示。由圖1可知:EAEFP在65 min時(shí)出現(xiàn)最大峰,說明EAEFP中鞣花酸占絕大部分,根據(jù)峰面積計(jì)算得出此提取物中鞣花酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)90.41%,其他物質(zhì)未確定。

        2.2 石榴鞣花酸提取物對(duì)A549肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用

        利用MTT比色法分析EAEFP對(duì)A549肺癌細(xì)胞存活率的影響,結(jié)果如圖2所示。圖2中,圖柱上方不同字母表示差異顯著(P<0.05)。由圖2可知:隨著EAEFP質(zhì)量濃度的增大,A549肺癌細(xì)胞的存活率逐漸降低,呈現(xiàn)較好的劑量效應(yīng)。當(dāng)EAEFP質(zhì)量濃度為0.88 μg/mL時(shí),細(xì)胞存活率為83.54%,與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。當(dāng)EAEFP質(zhì)量濃度為15.00 μg/mL 時(shí),細(xì)胞存活率僅為35.77%??梢奅AEFP對(duì)A549肺癌細(xì)胞的增殖具有良好的抑制作用。

        圖1 EAEFP成分HPLC圖

        圖2 EAEFP對(duì)A549肺癌細(xì)胞存活率的影響

        2.3 石榴鞣花酸提取物對(duì)A549肺癌細(xì)胞形態(tài)的影響

        A549肺癌細(xì)胞經(jīng)EAEFP處理后,利用DAPI染色法對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析,結(jié)果如圖3所示。圖3a為空白對(duì)照組,由圖3a可見:細(xì)胞大小均一,輪廓清楚,未見明顯的懸浮細(xì)胞。圖3b為3 μg/mL EAEFP處理后的細(xì)胞,由圖3b可見:A549肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到顯著的抑制,細(xì)胞數(shù)量明顯減少,細(xì)胞核出現(xiàn)了一定程度的皺縮,甚至出現(xiàn)了一些細(xì)胞碎片。且對(duì)細(xì)胞的這種破壞隨著EAEFP質(zhì)量濃度的提高而加劇(見圖3c)。因此,初步推斷EAEFP具有促使A549肺癌細(xì)胞形態(tài)異?;淖饔?,從而促進(jìn)了A549肺癌細(xì)胞的凋亡,這一發(fā)現(xiàn)與白花蛇舌草乙醇提取物對(duì)A549肺癌細(xì)胞的作用途徑相似[17]。

        (a) 對(duì)照組 (b) 3 μg/mL EAEFP (c) 6 μg/mL EAEFP

        圖3 EAEFP對(duì)A549肺癌細(xì)胞形態(tài)的影響(200倍)

        2.4 石榴鞣花酸提取物對(duì)A549肺癌細(xì)胞周期的影響

        細(xì)胞的分裂一般分為3個(gè)階段,分別為G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)。為了探究EAEFP對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用是否與其阻滯了細(xì)胞周期有關(guān),本文利用流式細(xì)胞儀分析EAEFP作用于A549肺癌細(xì)胞48 h后,對(duì)A549肺癌細(xì)胞周期的影響,如圖4所示。

        (a) 對(duì)照組

        (b) 3 μg/mL EAEFP

        (c) 6 μg/mL EAEFP

        (d) 各時(shí)相細(xì)胞個(gè)數(shù)百分比統(tǒng)計(jì)圖

        從圖4a~圖4c可以看出:當(dāng)3 μg/mL和6 μg/mL的EAEFP作用于A549肺癌細(xì)胞 48 h后,S期細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯少于對(duì)照組,且隨著EAEFP質(zhì)量濃度的增大,S期細(xì)胞個(gè)數(shù)越來越少。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(見圖4d):EAEFP作用于A549肺癌細(xì)胞后,G1期細(xì)胞個(gè)數(shù)百分比由66.93%增加至81.66%,S期細(xì)胞個(gè)數(shù)百分比由29.20%降低至15.21%,G2期細(xì)胞個(gè)數(shù)百分比無明顯變化。這表明EAEFP將A549肺癌細(xì)胞阻滯在G1期,抑制A549肺癌細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期,影響DNA正常復(fù)制,從而抑制了A549肺癌細(xì)胞的增殖。

        2.5 石榴鞣花酸提取物對(duì)A549肺癌細(xì)胞凋亡的影響

        采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀分析EAEFP對(duì)A549肺癌細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果如圖5所示。圖5a~5c中:橫坐標(biāo)為熒光探針Annexin V-FITC的信號(hào)強(qiáng)度;縱坐標(biāo)為熒光探針PI的信號(hào)強(qiáng)度。圖5a~圖5c為A549肺癌細(xì)胞Annexin V/PI染色點(diǎn)陣圖。圖5d為A549肺癌細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)圖,圖柱上方不同字母表示差異顯著(P<0.05)。從圖5a~圖5c可以看出:當(dāng)3 μg/mL和6 μg/mL的EAEFP作用于A549肺癌細(xì)胞 48 h后,細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯高于對(duì)照組,且有劑量依賴關(guān)系。圖5d顯示兩個(gè)質(zhì)量濃度處理組的A549肺癌細(xì)胞凋亡率分別為10.41%和17.35%,均顯著高于對(duì)照組A549肺癌細(xì)胞凋亡率(P<0.05)。表明EAEFP能誘導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞凋亡并呈劑量依賴性。

        (a) 對(duì)照組

        (b) 3 μg/mL EAEFP

        (c) 6 μg/mL EAEFP

        (d) 細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)圖

        3 結(jié)束語(yǔ)

        石榴鞣花酸提取物能顯著抑制A549肺癌細(xì)胞的增殖,且在質(zhì)量濃度為0~15 μg/mL時(shí)呈現(xiàn)良好的劑量效應(yīng)。石榴鞣花酸提取物可以使A549肺癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,細(xì)胞核發(fā)生皺縮,且隨質(zhì)量濃度增大,細(xì)胞核皺縮更加嚴(yán)重。石榴鞣花酸提取物可以干擾A549肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)周期,將細(xì)胞阻滯在G1期,抑制細(xì)胞DNA正常復(fù)制。石榴鞣花酸提取物可以引起A549肺癌細(xì)胞凋亡,且呈劑量依賴性。

        石榴鞣花酸提取物對(duì)A549肺癌細(xì)胞具有良好的凋亡作用,是潛在的抗癌天然物質(zhì)。文獻(xiàn)[18]指出樹莓鞣花酸對(duì)肝癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞等具有顯著的抑制作用,發(fā)現(xiàn)鞣花酸在癌細(xì)胞分裂過程中,鞣花酸組織細(xì)胞有絲分裂G0/G1期的轉(zhuǎn)換,抑制了細(xì)胞DNA的合成,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,本研究的結(jié)果與此基本吻合。文獻(xiàn)[19]研究發(fā)現(xiàn):鞣花酸能夠與姜黃素協(xié)同作用,共同誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生,使p53蛋白大量累積,誘導(dǎo)了癌細(xì)胞的大量凋亡。文獻(xiàn)[20]利用膜透析技術(shù)制備鞣花酸的雙載核殼納米粒,優(yōu)化后的顆粒觀察到更高的細(xì)胞毒性,可作為乳腺癌治療聯(lián)合用藥。這些文獻(xiàn)均提示鞣花酸對(duì)肺癌細(xì)胞等癌細(xì)胞具有顯著抑制作用。但關(guān)于石榴鞣花酸提取物誘導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞凋亡的研究報(bào)道較少,其作用機(jī)制和凋亡通路更是缺乏研究。本文明確了石榴鞣花酸提取物對(duì)A549肺癌細(xì)胞的凋亡作用以及作用機(jī)制,可以拓展石榴鞣花酸的應(yīng)用領(lǐng)域,進(jìn)一步指導(dǎo)該天然產(chǎn)物在抗癌功能上的應(yīng)用。

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