任鈺婷，邱智軍，張 彬，趙 淵，馬瓊瓊，原江鋒

(河南科技大學 a.食品與生物工程學院; b.農學院/牡丹學院，河南 洛陽 471023)

0 引言

隨著生物技術，尤其是分子生物學技術的快速發(fā)展，下游分離技術逐漸成為制約整個生物產業(yè)發(fā)展的瓶頸[1]。因此，開發(fā)高效的分離純化方法對于生物產業(yè)發(fā)展至關重要。親和色譜技術由于具有高選擇性、易于放大和易于工藝開發(fā)等優(yōu)勢而備受關注[2]。親和色譜成功的關鍵在于親和配基的選擇。在目前已開發(fā)的親和配基中，染料分子配基，特別是三嗪基染料分子配基由于具有價格低廉、穩(wěn)定性強且不易降解等特點而得到廣泛應用[3]。

作為三嗪基染料分子的代表，以汽巴藍(cibacron blue)為配基的親和色譜介質已廣泛用于人血清白蛋白[4]、激酶[5]、限制性內切酶[6]、脂酶[7]和木聚糖酶[8]等蛋白的純化，在生物、醫(yī)藥和食品等領域具有重要的應用價值。近年來，與汽巴藍具有類似分子結構的其他三嗪基染料分子也作為親和配基，逐步應用于多種蛋白質的分離和純化。例如，以活性棕10(reactive brown 10)作為親和配基，通過親和色譜法可以從轉基因棉籽中一步純化獲得磷酸肌醇乙酰轉移酶[9]；以活性綠5(reactive green 5)為親和配基，使用自由基共聚法制備的親和超大孔聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)整體柱一步純化獲得了木瓜蛋白酶[10]。

盡管越來越多的三嗪基染料分子作為親和配基在蛋白色譜應用中取得成功，但目前的研究主要集中在新型色譜介質的制備和色譜方法的建立等方面[11-12]，而對于三嗪基染料分子與目標蛋白質相互作用的研究較少，這極大地限制了三嗪基染料配基的進一步應用以及新型配基分子的設計。因此，為了明確三嗪基染料配基與蛋白質相互作用的分子機制，本研究基于前期對一系列結構類似的三嗪基染料分子的篩選結果，選擇具有良好吸附效果的活性藍4(reactive blue 4，RB-4)作為親和配基，通過紫外吸收光譜、熒光光譜和同步熒光光譜等光譜學手段和分子對接方法，研究了RB-4與模式蛋白牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)之間的結合作用機制，可為三嗪基染料分子作為配體的親和色譜方法的建立，以及新型配基的設計提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

RB-4和BSA，購自Sigma-Aldrich公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉和乙醇等試劑均為分析純，購自天津市德恩化學試劑有限公司；試驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

Agilent Cary Eclips型熒光分光光度計，安捷倫科技(中國)有限公司；L5S型紫外分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；STARTER 3100型pH計，上海奧豪斯儀器有限公司；AR1502CN型電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；HB120-S型數顯恒溫金屬浴加熱器，大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司。

1.3 紫外吸收光譜分析

用濃度為20 mmol/L的醋酸鈉緩沖液(pH為4.5)將BSA溶解，配制成濃度為0.025 mmol/L的溶液。將所配制的BSA溶液與不同濃度的RB-4溶液等體積混合，在25 ℃靜置反應2 h。反應結束后，在270～300 nm波長掃描各混合物的紫外吸收光譜。

1.4 熒光光譜分析

用濃度為20 mmol/L的醋酸鈉緩沖液(pH為4.5)將BSA溶解，配制成濃度為0.025 mmol/L的溶液。將所配制的BSA溶液與不同濃度的RB-4溶液等體積混合，分別在25 ℃、35 ℃和45 ℃下靜置反應2 h。反應結束后，測定各混合物的熒光光譜。熒光光譜測定儀器參數：激發(fā)波長λex為280 nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，電壓600 V，熒光掃描發(fā)射波長λem為270～450 nm，同步熒光掃描激發(fā)波長為270～310 nm。三維熒光光譜主要參數：掃描模式為3-D Scan，數據模式為Fluorescance，發(fā)射波長λem為200～450 nm，激發(fā)波長λex為200～350 nm，激發(fā)狹縫為5.0 nm，發(fā)射狹縫為5.0 nm，光電倍增管電壓為600 V，掃描速度為120 nm·min-1。

1.5 分子對接

BSA的晶體結構取自蛋白質數據庫RCSB Protein Data Bank(PDB)(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)，PDB ID：3V03。RB-4結構由Chemical draw軟件繪制。分析之前用UltraEdit軟件去除BSA結構中自帶的配體、水和游離氫原子。用Discovery Studio軟件優(yōu)化RB-4的結構模型(加力場)，分析BSA的活性區(qū)域。通過軟件識別分析得出BSA有36個活性位點可供配體進行對接，選擇評分第一的位點作為對接位點，用LibDock 模塊進行分子對接。對接完成后產生14個對接構象，選擇評分最高(107.365)的對接構象作為對接結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 紫外吸收光譜分析

圖1 RB-4與BSA相互作用的紫外吸收光譜圖

圖1為RB-4與BSA相互作用的紫外吸收光譜圖。圖1中，g→a線表示曲線所對應的RB-4濃度的變化方向，即從上至下曲線所對應的RB-4濃度分別為0.125 0 mmol/L、0.100 0 mmol/L、0.075 0 mmol/L、0.050 0 mmol/L、0.025 0 mmol/L、0.012 5 mmol/L和0 mmol/L。由圖1可以看出：在不添加RB-4的情況下，BSA在波長279 nm處具有特征吸收峰。隨著RB-4溶液濃度的增加，BSA的特征吸收峰位置未發(fā)生改變，但吸光度隨之增大。BSA在波長279 nm處的特征吸收峰主要是由其肽鏈上色氨酸和酪氨酸的苯雜環(huán)π-π*躍遷所引起的[13]，由此可見，RB-4的加入會誘導BSA分子發(fā)生蛋白質肽鏈伸展，使內部疏水性的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環(huán)基團暴露，吸光度增強?；诖耍贤馕展庾V分析顯示RB-4與BSA之間存在特定的相互作用，但具體的作用模式需要進一步確定。

2.2 內源熒光光譜和熒光淬滅機制

BSA分子中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等一系列能夠發(fā)射內源熒光的氨基酸殘基，因此，可以通過內源熒光的變化來反映RB-4與BSA之間的相互作用以及RB-4所引起B(yǎng)SA的構象變化。圖2為RB-4與BSA相互作用的內源熒光光譜與Stern-Volmer方程擬合圖。圖2中，a→g線表示曲線所對應的RB-4濃度的變化方向，即從上至下曲線所對應的RB-4濃度分別為0 mmol/L、0.012 5 mmol/L、0.025 0 mmol/L、0.050 0 mmol/L、0.075 0 mmol/L、0.100 0 mmol/L和0.125 0 mmol/L，下同；F0為未加入RB-4時BSA的熒光強度；F為加入不同濃度RB-4時BSA的熒光強度。如圖2a所示，在280 nm激發(fā)波長下，BSA具有明顯的熒光發(fā)射，且在342 nm具有最大發(fā)射峰。隨著RB-4濃度的增加，熒光發(fā)射強度逐漸降低并伴隨最大發(fā)射峰輕微藍移，表明隨著RB-4的加入，BSA發(fā)生熒光淬滅。

(a) 25 ℃時的內源熒光光譜

引起蛋白質發(fā)生熒光淬滅的原因包括動態(tài)淬滅、靜態(tài)淬滅，以及基于不同淬滅機制的動態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅的組合[14]。在動態(tài)淬滅過程中，蛋白質與淬滅劑通過碰撞引起動態(tài)淬滅。因此，隨著溫度的升高，擴散系數增大，電子轉移增強，動態(tài)淬滅常數也相應增大。在靜態(tài)淬滅條件下，蛋白質與淬滅劑形成基態(tài)復合物，所形成復合物的穩(wěn)定性隨溫度的升高而降低，因此，靜態(tài)淬滅常數隨溫度的升高而降低。動態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅的組合，則是由蛋白質與淬滅劑通過碰撞以及基態(tài)復合物的形成共同引起的[15]。對于動態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅，Stern-Volmer方程中的F0/F與Q之間成線性關系[13]。基于此，使用Stern-Volmer方程[13]分析了BSA的熒光淬滅過程。

表1 RB-4與BSA相互作用的Stern-Volmer常數

使用Stern-Volmer方程對不同溫度條件下BSA的熒光強度進行擬合(見圖2b)，擬合結果即RB-4與BSA相互作用的Stern-Volmer常數(見表1)。表1中，KSV為Stern-Volmer淬滅常數；Kq為由擴散過程控制的雙分子動態(tài)熒光淬滅速率常數與單分子衰變速率常數的比值。從表1可以看出：在RB-4與BSA的相互作用過程中，擬合后的R2均不低于0.97，表明F0/F與Q之間成線性關系且斜率為負值，RB-4對BSA的淬滅機制為靜態(tài)淬滅；另外，在RB-4對BSA的淬滅過程中，Kq>2.0×1010mol·L-1·s-1，且隨著溫度升高，Kq減小，表明RB-4與BSA所形成的復合物在高溫下不穩(wěn)定，進一步證明該過程為靜態(tài)淬滅[16]。

2.3 RB-4對BSA的結合常數和結合位點數

對于靜態(tài)淬滅過程，可根據Lineweaver-Burk雙對數方程進行計算，獲得RB-4與BSA相互作用的結合常數KA和結合位點數n[17]。

表2 Lineweaver-Burk雙對數方程的擬合結果

表2為Lineweaver-Burk雙對數方程的擬合結果。由表2可知：RB-4與BSA之間的結合位點數n接近2，表明RB-4與BSA大致具有2個結合位點；隨溫度升高，n值變化不大，表明RB-4與BSA具有較強的相互作用。隨著溫度的升高，KA減小，符合靜態(tài)淬滅的特征[18]。

蛋白質與小分子化合物之間的結合強度可以通過結合常數KA來表示，KA值越大，則結合強度越大。在藥物分子(例如羅利環(huán)素、卡比多巴)與BSA的結合過程中，其KA值通常為103～104，表明這些藥物分子與BSA之間形成了強結合[19-20]。然而，在本研究中，RB-4與BSA之間的結合常數KA為102～103，明顯小于這些藥物分子與BSA之間的結合強度。與藥物分子不同，色譜配基除了要與目標蛋白質形成穩(wěn)定結合外，還需要考慮在分離結束時，能夠將目標蛋白質從色譜介質上洗脫下來，因此結合強度不宜過大。

由于目前對于使用光譜法研究色譜配基與蛋白質相互作用的報道較少，因此無法根據文獻判斷色譜配基適合的KA范圍。然而，在后續(xù)研究中，用RB-4官能化的色譜介質對BSA表現出良好的吸附和解吸性能。因此，可以推斷102～103的KA對于色譜配基是較為適宜的。

2.4 RB-4與BSA相互作用的熱力學參數

熱力學參數，如吉布斯自由能變化(△G)、焓變(△H)和熵變(△S)可以指示小分子化合物與蛋白質的相互作用模式和作用力類型。使用van′t-Hoff方程計算了RB-4與BSA相互作用過程中的熱力學參數△G、△H和△S，計算結果見表3。

表3 RB-4與BSA相互作用的熱力學參數

由表3可知：在RB-4與BSA的反應過程中△G<0，表明RB-4與BSA之間的結合是自發(fā)進行的。小分子化合物與蛋白質的作用力類型主要包括疏水作用、范德華力、靜電作用及氫鍵。根據△S和△H值的大小，可以判斷相互作用過程中所存在的主要作用力，即當△H<0、△S<0時，表明該過程的主要作用力可能是氫鍵和范德華力；當△H>0、△S>0時，表明該過程的主要作用力是典型的疏水作用；當△H<0、△S>0時，表明該過程的主要作用力是靜電作用。在本研究中，△H和△S均大于0，因此可以認為RB-4與BSA之間的主要作用力為疏水作用。

2.5 同步熒光光譜

同步熒光光譜可以用于指示熒光團附近的分子微環(huán)境。當將激發(fā)波長和發(fā)射波長之間的波長差△λ固定為15 nm和60 nm時，所獲得的同步熒光光譜分別代表了蛋白質中酪氨酸殘基和色氨酸殘基的光譜特征[21]。因此，可以基于熒光發(fā)射波長的改變來判斷蛋白質構象的變化情況。

圖3為RB-4與BSA相互作用的同步熒光光譜。如圖3所示，當△λ=15 nm(見圖3a)和△λ=60 nm(見圖3b)時，同步熒光光譜顯示RB-4的加入使BSA的特征吸收峰降低，且使最大熒光發(fā)射波長分別藍移約7 nm和5 nm。表明RB-4與BSA的結合導致酪氨酸殘基和色氨酸殘基周圍的疏水性增強，且對酪氨酸殘基的影響更大，結合過程導致BSA的構象發(fā)生變化。

(a) △λ=15 nm

(b) △λ=60 nm

2.6 三維熒光光譜

三維熒光光譜能準確、可靠地檢驗蛋白質的結構和微環(huán)境變化。圖4為RB-4與BSA相互作用的三維熒光光譜。由圖4可知：在兩個體系中存在特征為△λem=△λex的瑞利散射，即圖4中所示的“山脊”峰(峰A)[22]。另外，對于BSA(見圖4a)，在△λem=345 nm處存在峰B，這是由BSA中氨基酸的π-π*躍遷所造成的。而對于RB-4與BSA結合的反應體系(見圖4b)，峰B的熒光強度顯著降低，且λem發(fā)生輕微藍移(λem=343 nm)，表明在酪氨酸殘基和色氨酸殘基周圍微環(huán)境中的疏水性增強，這與同步熒光光譜的結果一致。

(a) BSA

(b) RB-4與BSA結合

2.7 分子對接

為了進一步闡明RB-4與BSA之間的結合特性，進行分子對接試驗以確定配基和蛋白質分子之間的最佳結合位點。

BSA分子的三維結構呈心形，具有3個相似的結構域：結構域Ⅰ(1～183氨基酸殘基)、結構域Ⅱ(184～376氨基酸殘基)和結構域Ⅲ(377～583氨基酸殘基)，其中大部分的小分子與BSA的作用位置位于由亞結構域Ⅱ和亞結構域Ⅲ所形成的疏水性腔內[23]。

圖5為RB-4與BSA的分子對接模型。圖5a顯示了RB-4與BSA分子對接的整體結果，在此構象下，結合自由能最低。RB-4與BSA對接時，周邊存在11個氨基酸殘基，包括離子型氨基酸殘基：Glu-564和His-509；疏水型殘基：Phe-567、Ala-568、Ala-510、Val-575、Pro-572、Phe-508和Phe-506；親水型殘基：Gly-571和Thr-507。其中，Phe-508、Ala-510、Glu-564與RB-4形成5個氫鍵(見圖5b)。分子對接結果表明：BSA與RB-4之間的主要作用力為疏水作用，同時還存在一定的靜電作用與氫鍵作用，該結果與光譜試驗結果一致。

(a) 整體圖

3 結論

(1)RB-4與BSA發(fā)生相互作用，使BSA內部疏水性的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環(huán)基團暴露。

(2)RB-4與BSA通過靜態(tài)淬滅機制形成穩(wěn)定的復合物，從而使BSA熒光淬滅。RB-4與BSA的結合過程是自發(fā)放熱過程，低溫有利于兩者的結合，且疏水相互作用力是維持RB-4與BSA結合的主要作用力。

(3)RB-4與BSA的結合導致BSA的三級結構被破壞，空間結構變得松散，從而使酪氨酸殘基和色氨酸殘基周圍微環(huán)境的疏水性增強。

(4)BSA與RB-4之間的主要氨基酸作用位點為Phe-567、Ala-568、Ala-510、Val-575、Pro-572、Phe-508和Phe-506，同時還存在一定的靜電作用與氫鍵作用。