劉利琴 彭瀟 馬雪 李勇軍 劉春花 潘潔 王永林 王愛(ài)民

中圖分類號(hào) R282 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）12-1458-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.12.10

摘 要 目的：為提升貴州產(chǎn)紅孩兒藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。方法：收集5批貴州產(chǎn)紅孩兒藥材，觀察藥材粉末的顯微特征，參照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則相關(guān)方法，采用薄層色譜法（TLC）對(duì)紅孩兒藥材進(jìn)行定性鑒別并測(cè)定其水分、總灰分及水溶性浸出物的含量;采用高效液相色譜法測(cè)定紅孩兒藥材中蘆丁的含量。結(jié)果：紅孩兒藥材粉末呈棕褐色，石細(xì)胞類方形、類多角形或不規(guī)則形;淀粉粒眾多，復(fù)粒稀少;可見(jiàn)導(dǎo)管、草酸鈣方晶/簇晶;在與紅孩兒對(duì)照藥材TLC圖譜相同位置處顯相同熒光斑點(diǎn)。5批紅孩兒藥材中水分含量為10.15%～11.41%，總灰分含量為8.70%～12.59%，水溶性浸出物含量為16.91%～19.58%。蘆丁檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為18.47～147.8 μg/mL（r=0.999 8），重復(fù)性、中間精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn)（8 h）的RSD均小于3.0%，平均加樣回收率為99.39%～100.29%（RSD為0.23%～2.59%，n=3）;5批紅孩兒藥材中蘆丁的含量為0.102%～0.198%。結(jié)論：藥材水分、總灰分含量分別不得超過(guò)13.0%、14.0%，水溶性浸出物、蘆丁含量分別不得低于15.0%、0.080%。本研究所建質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可用于紅孩兒藥材的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 紅孩兒;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);顯微觀察;水分;總灰分;水溶性浸出物;蘆丁;含量測(cè)定

Study on Quality Standard Improvement of Rhizoma Begoniae from Guizhou

LIU Liqin1，2，PENG Xiao1，2，MA Xue3，LI Yongjun3，LIU Chunhua3，PAN Jie3，WANG Yonglin1，WANG Aimin3（1.Guizhou Key Lab of Pharmaceutical Preparation/State Key Lab of Medicinal Plant Function and Utilization， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China;2. College of Pharmacy， Guizhou Medical University，Guiyang 550025， China; 3. Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To provide reference for improving the quality standard of Rhizoma Begoniae from Guizhou. METHODS： Five batches of Rhizoma Begoniae from Guizhou were collected， and the microscopic characteristics of the Rhizoma Begoniae powder were observed. According to the corresponding methods in 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia （part Ⅳ）， qualitative identification of Rhizoma Begoniae was conducted by TLC， and the contents of moisture， total ash and water-soluble extract in Rhizoma Begoniae were determined. The contents of rutin were determined by HPLC. RESULTS： The powder of Rhizoma Begoniae medicinal materials was brown， stone cells were square， polygonal-like or irregular. There were many starch grains and few complex grains. The conduit， calcium oxalate square crystal/cluster crystal were visible. The same fluorescence spots were found in the same location of TLC atlas of Rhizoma Begoniae control herb. The moisture， total ash， water-soluble extract contents were 10.15%-11.41%， 8.70%-12.59% and 16.91%-19.58%， respectively. The linear range of rutin were 18.47-147.8 μg/mL （r=0.999 8）; RSDs of reproducibility， intermediate precision and stability tests （8 h） were all lower than 3.0%; the average recoveries were 99.39%-100.29% （RSDs were 0.23%-2.59%， n=3）; the contents of rutin in 5 batches of Rhizoma Begoniae were 0.102%-0.198%. CONCLUSIONS： The contents of moisture and total ash shall not exceed 13.0% and 14.0% respectively， and the contents of water-soluble extract and rutin shall not be less than 15.0% and 0.080%. The quality standard established in this study can be used for the quality control of Rhizoma Begoniae from Guizhou.

KEYWORDS ? Rhizoma Begoniae; Quality standard; Microscopic observation; Moisture; Total ash; Water-soluble extract; ?Rutin; Content determination

紅孩兒為秋海棠科植物裂葉秋海棠（Begonia palmata D. Don）或昌感秋海棠（Begonia cavalerei Lévl.）的新鮮或干燥根莖;夏、秋二季采收，除去泥沙，洗凈，鮮用或曬干;主要分布于我國(guó)貴州、云南、廣西等地，為貴州省少數(shù)民族常用藥[1-2]。該藥具有活血通經(jīng)、清熱解毒等功效，主要用于治療風(fēng)濕熱痹、疔瘡癰腫、肺熱咳嗽、肺癆、痛經(jīng)、跌撲腫痛、蛇咬傷等癥[3-4]。秋海棠屬植物全草和根莖中化學(xué)成分主要有糖類和黃酮、強(qiáng)心苷、蒽醌、三萜、揮發(fā)油、鞣質(zhì)、甾醇、皂苷類等[5-7]，具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗凝血、降血糖血脂等生物活性[8-10]，臨床上曾以紅孩兒濃縮液治療傷寒并發(fā)重度腸出血[11]。 但《中國(guó)藥典》并未收錄紅孩兒，而在《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中，紅孩兒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下僅有性狀描述[1]，尚無(wú)完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?；诖?，本研究根據(jù)紅孩兒的特點(diǎn)，參照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）和《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及起草說(shuō)明編寫技術(shù)要求》相關(guān)內(nèi)容，使用顯微鏡及薄層色譜法對(duì)貴州產(chǎn)的紅孩兒藥材進(jìn)行定性鑒別，并考察其水分、總灰分和水溶性浸出物，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定紅孩兒藥材中蘆丁的含量，旨為提升紅孩兒藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

50i型顯微鏡、DS-Fi2型顯微成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）;Reprostar 3型薄層色譜成像系統(tǒng)（瑞士Camag公司）;雙三元UlMate 3000型、UlMate 3000型、Ultimate 3000型HPLC儀[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司];Prominence LC-20A型HPLC儀（日本Shimadzu公司）。

1.2 藥品與試劑

5批紅孩兒藥材均產(chǎn)自貴州，由貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥用植物與生藥學(xué)教研室張旭副教授鑒定為昌感秋海棠（B. cavalerei Lévl.）或裂葉秋海棠（B. palmata D. Don）新鮮或干燥的根及根莖。蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-201409，純度：91.9%）;乙腈（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170619，優(yōu)級(jí)純）;其余試劑均為分析純，水為超純水。紅孩兒藥材來(lái)源信息詳見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別

2.1.1 顯微鑒別

取5批紅孩兒藥材，粉碎后，采用顯微鏡和顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行顯微鑒別。40倍顯微鏡下，紅孩兒藥材粉末顯棕褐色;呈石細(xì)胞類方形、類多角形或不規(guī)則形，直徑為50～380 μm，也有延長(zhǎng)呈纖維狀，長(zhǎng)至600 μm;紅孩兒藥材中，壁厚者層紋明顯，紋孔稀疏，有的胞腔較大;淀粉粒眾多，多為單粒，呈扁卵形、類圓形或三角卵形，直徑為10～70 μm，臍點(diǎn)點(diǎn)狀，可見(jiàn)層紋，復(fù)粒稀少，由2～3分粒組成;草酸鈣方晶單個(gè)散在，為長(zhǎng)方形或類方形，直徑為10～40 μm;草酸鈣簇晶散在，直徑為50～100 μm;導(dǎo)管多為螺紋或梯紋，直徑為30～70 μm，詳見(jiàn)圖1。

2.1.2 薄層色譜鑒別

（1）樣品鑒別。取各批次紅孩兒藥材粉末（過(guò)二號(hào)篩）0.5 g，加甲醇10 mL，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）處理20 min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取紅孩兒對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。以甲醇作為陰性對(duì)照溶液，按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“0502薄層色譜法”[12]，吸取上述供試品溶液和對(duì)照藥材溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇（5 ∶ 2 ∶ 1，V/V/V）為展開(kāi)劑，在25 ℃、58%相對(duì)濕度下展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置于紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相同位置處，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，詳見(jiàn)圖2。

（2）耐用性考察。按照“2.1.2（1）”項(xiàng)下薄層色譜法，分別考察4批紅孩兒藥材和對(duì)照藥材在不同廠家硅膠G板（青島海洋硅膠G板、煙臺(tái)江友硅膠HSG板、青島鼎康硅膠G板）、不同相對(duì)濕度（32%、58%、72%）、不同溫度（10、25、35 ℃）下的展開(kāi)效果。結(jié)果，5批紅孩兒藥材的薄層色譜圖中的熒光斑點(diǎn)均無(wú)明顯變化，表明該方法耐用性良好，詳見(jiàn)圖3～圖5。

2.2 檢查

2.2.1 水分

按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“0832水分測(cè)定法第二法（烘干法）”[12]測(cè)定并計(jì)算5批紅孩兒藥材中的水分含量（%），每批藥材重復(fù)測(cè)定2次，取平均值作為結(jié)果。結(jié)果，5批紅孩兒藥材的水分含量為10.15%～11.41%，平均值為10.77 %，詳見(jiàn)表2。以平均值上浮約20%暫定本品水分不得超過(guò)13.0%。

2.2.2 總灰分

按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“2302灰分測(cè)定法”[12]測(cè)定并計(jì)算5批紅孩兒藥材中的總灰分含量，每批藥材重復(fù)測(cè)定2次，取平均值作為結(jié)果。結(jié)果，5批紅孩兒藥材的總灰分含量為8.70%～12.59%，平均值為11.01%，詳見(jiàn)表2。以平均值上浮約20%暫定本品總灰分不得超過(guò)14.0%。

2.2.3 水溶性浸出物

紅孩兒民間習(xí)用方法為水煎煮，故本研究選擇以水為溶劑進(jìn)行水溶性浸出物測(cè)定。按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“2201浸出物測(cè)定法”中“水溶性浸出物測(cè)定法熱浸法”[12]測(cè)定并計(jì)算5批紅孩兒藥材的水溶性浸出物含量（%），每批藥材重復(fù)測(cè)定2次，取平均值作為結(jié)果。結(jié)果，5批紅孩兒藥材的水溶性浸出物含量為16.91%～19.58%，平均值為18.09%，詳見(jiàn)表2。以平均值下浮約20%暫定本品水溶性浸出物不得低于15.0%。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 供試品溶液的制備

取紅孩兒藥材粉末（過(guò)三號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，置于水浴中加熱回流提取1 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備

稱取蘆丁對(duì)照品適量，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得每1 mL含蘆丁0.147 8 mg的對(duì)照品貯備液。精密量取上述對(duì)照品貯備液5 mL，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得每1 mL含蘆丁73.90 μg的對(duì)照品溶液。

2.3.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱為Venusil XBP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（20 ∶ 80，V/V）;流速為1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為258 nm;柱溫為35 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。取陰性對(duì)照溶液（甲醇）、“2.3.1”項(xiàng)下供試品溶液和“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液各適量，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖6。

結(jié)果顯示，紅孩兒藥材中蘆丁的保留時(shí)間約為5.7 min，與其余色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)以蘆丁峰計(jì)為6 000。暫定紅孩兒藥材的理論板數(shù)以蘆丁計(jì)不得低于5 000。

2.3.4 線性關(guān)系考察

精密量取蘆丁對(duì)照品貯備液1.25、2.5、5、7.5、10 mL，分別置于5個(gè)10 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得蘆丁質(zhì)量濃度分別為18.47、36.95、73.90、110.8、147.8 μg/mL的系列對(duì)照品溶液。取上述系列對(duì)照品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程：y=0.358 4x-0.100 8（r=0.999 8）。結(jié)果表明，蘆丁檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為18.47～147.8 μg/mL。

2.3.5 精密度考察

（1）重復(fù)性試驗(yàn)。分別精密稱取紅孩兒藥材粉末（批號(hào)：20170727）0.5、1、1.5 g，各3份，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。結(jié)果，紅孩兒藥材中蘆丁含量的RSD分別為0.2%、1.07%、1.69%（n=3），表明該方法重復(fù)性良好。

（2）中間精密度試驗(yàn)。由2名不同的實(shí)驗(yàn)人員在不同時(shí)間分別精密稱取紅孩兒藥材粉末（批號(hào)：20170727）1 g，各3份，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。結(jié)果，紅孩兒藥材中蘆丁含量的RSD為2.3%（n=6），表明該方法中間精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取紅孩兒藥材粉末（批號(hào)：20170727）1 g，按“2.3.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、1、2、4、8 h時(shí)按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，蘆丁峰面積的RSD為0.58%（n=5），表明供試品溶液在室溫下放置8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取9份已知含量的紅孩兒藥材粉末（批號(hào)：20170727）0.5 g，分別按樣品含量的50%、100%、150%加入蘆丁對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.8 耐用性試驗(yàn)

稱取紅孩兒藥材粉末（批號(hào)：20170727）1 g，精密稱定，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別記錄不同流動(dòng)相比例[乙腈-0.1%磷酸水溶液（19 ∶ 81、20 ∶ 80、21 ∶ 79，V/V）];不同酸度[只改變流動(dòng)相中磷酸濃度，比例均為20 ∶ 80（V/V）：乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.15%磷酸水溶液];不同流速（0.90、1.0、1.1 mL/min）;不同色譜柱[Puls C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Venusil XBP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）];不同檢測(cè)波長(zhǎng)（256、258、260 nm）;不同柱溫（32、35、38 ℃）以及不同型號(hào)HPLC儀（雙三元UlMate 3000、UlMate3000、Prominence LC-20A）下的峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。結(jié)果顯示，不同條件下紅孩兒藥材中蘆丁含量的RSD均小于1.0%，表明該方法耐用性良好。

2.3.9 樣品測(cè)定

分別取各批次紅孩兒藥材粉末1 g，精密稱定，按“2.3.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，每批藥材重復(fù)測(cè)定2次。結(jié)果，5批紅孩兒藥材的蘆丁含量為0.102%～0.198%，平均值為0.154%，詳見(jiàn)表4。以最低值下浮20%暫定紅孩兒藥材中蘆?。–27H30O16）含量不得低于0.080%。

3 討論

3.1 對(duì)照藥材的選擇

批號(hào)20170727的紅孩兒藥材的全株是于2017年7月（夏季）現(xiàn)場(chǎng)采集，并經(jīng)過(guò)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥用植物與生藥學(xué)教研室張旭副教授鑒定為《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003版收載的昌感秋海棠（B. cavalerei Lévl.），并按上述標(biāo)準(zhǔn)收載的紅孩兒藥材加工方法加工而成（根及根莖部分），故以其為對(duì)照藥材。

3.2 含量測(cè)定中供試品溶液制備方法的選擇

在含量測(cè)定試驗(yàn)中，筆者分別考察了不同提取方法（超聲提取、回流提取、索氏提取）、不同提取溶劑（95%甲醇、75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇和95%乙醇、75%乙醇、50%乙醇、25%乙醇、水）及不同提取時(shí)間（0.5、1、4 h）對(duì)紅孩兒藥材中蘆丁提取率的影響。結(jié)果顯示，制備供試品溶液的最佳方法是采用50%甲醇回流提取1 h。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

筆者通過(guò)觀察色譜圖及光譜圖發(fā)現(xiàn)，蘆丁在檢測(cè)波長(zhǎng)204、258、355 nm處均有吸收，但當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為258 nm時(shí)，色譜圖的基線更平穩(wěn)、色譜峰分離度更良好、靈敏度最高。因此，選擇258 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

綜上所述，本研究在原標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上增加紅孩兒藥材的顯微、薄層色譜鑒別，水分、總灰分、水溶性浸出物檢查項(xiàng)以及蘆丁含量測(cè)定，規(guī)定了藥材水分、總灰分分別不得超過(guò)13.0%、14.0%，水溶性浸出物、蘆丁含量分別不得低于15.0%、0.080%。本研究提升了2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載的紅孩兒藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可為紅孩兒藥材的質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)參考。

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（收稿日期：2020-01-13 修回日期：2020-03-18）

（編輯：鄒麗娟）