李燕 潘炎帆 張濤 韓忠耀

中圖分類號 R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）12-1470-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.12.12

摘 要 目的：優(yōu)化千里光藥材的提取工藝，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供方法參考。方法：采用80 ℃水浴回流提取的方法提取千里光藥材。采用高效液相色譜法測定綠原酸和金絲桃苷的含量，色譜柱為Diamonsil C18，流動(dòng)相為0.2%冰醋酸水溶液-甲醇（82 ∶ 18，V/V），柱溫為35 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測波長分別為327 nm，進(jìn)樣量為5 μL;采用紫外-可見分光光度法測定總黃酮（以蘆丁計(jì)）和總生物堿（以苦參堿計(jì)）的含量，檢測波長分別為509、208 nm。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A，%）、溶劑倍量（B，mL/g）、提取時(shí)間（C，h）、提取次數(shù)（D，次）為考察因素，以綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿的含量為評價(jià)指標(biāo)，通過信息熵賦權(quán)法計(jì)算上述各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)并以此計(jì)算其綜合評分，按L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化千里光提取工藝并進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：千里光藥材的最佳提取工藝為加入8倍量50%乙醇，回流提取3次，每次1.5 h;3次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，所得提取液中綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿含量的RSD均小于1.5%（n=3）。結(jié)論：優(yōu)化的提取工藝重復(fù)性好、穩(wěn)定可行，可用于千里光藥材的提取。

關(guān)鍵詞 千里光;信息熵賦權(quán)法;綠原酸;金絲桃苷;總黃酮;總生物堿;含量;正交試驗(yàn);提取工藝

Optimization of the Extraction Technology of Senecio scandens by Orthogonal Design Combined with Information Entropy Weighting Method

LI Yan，PAN Yanfan，ZHANG Tao，HAN Zhongyao（College of Pharmacy， Qiannan Medical College for Nationalities， Guizhou Duyun 558000， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To optimize the extraction technology of Senecio scandens， and to provide reference for the further development and utilization of the medicinal material. METHODS： The method of reflux extraction with 80 ℃ water bath was used to extract S. scandens. HPLC method was adopted to determine the contents of chlorogenic acid and hyperoside. The determination was performed on Diamonsil C18 with mobile phase consisted of 0.2% glacial acetic acid water solution-methanol （82 ∶ 18， V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min; the column temperature was set at 35 ℃; the detection wavelength was 327 nm， and the sample size was 5 μL. UV-Vis spectrophotometry was used to determine the contents of total flavonoids （by rutin） and total alkaloids （by matrine） and the detection wavelengths were set at 509 nm and 208 nm， respectively. Based on single factor tests， using ethanol volume fraction （A，%）， solvent folds （B， mL/g）， extraction time （C， h）， extraction times （D， times） as factors， using the contents of chlorogenic acid， hyperoside， total flavonoids and total alkaloids as indexes， and the weight coefficients of above indicator components were calculated based on information entropy weighting method so as to calculate their comprehensive scores， then L9（34） orthogonal design was used to further optimize the extraction technology. The validation tests were also performed. RESULTS： The optimal extraction technology of S. scandens included that 8-fold 50% ethanol， extracting for 3 times， lasting for 1.5 h each time. Results of 3 times of validation tests showed that RSDs of the contents of chlorogenic acid， hyperoside， total flavonoids and total alkaloids were all lower than 1.5% （n=3）. CONCLUSIONS： The optimized technology is reproducible， stable and feasible， and can be used for the extraction of S. scandens.

KEYWORDS ? Senecio scandens; Information entropy weighting theory; Chlorogenic acid; Hyperoside; Total flavonoids; Total alkaloids; Content; Orthogonal design; Extraction technology

千里光為菊科植物千里光（Senecio scandens Buch.-Ham.）的干燥地上部分，主要含黃酮、生物堿、有機(jī)酸類等化學(xué)成分，具有清熱解毒、明目退翳、殺蟲止癢、散瘀消腫等功效，被廣泛應(yīng)用于各種急性炎癥的治療[1-2];同時(shí)，千里光也是多種制劑如千柏鼻炎片、千里光眼藥水、千喜片等的組方藥材，因此其主要活性成分的提取對其相關(guān)制劑的開發(fā)應(yīng)用至關(guān)重要。已有研究采用總黃酮含量為單一評價(jià)指標(biāo)篩選千里光提取工藝[3]，然而中藥是通過多成分、多靶點(diǎn)來發(fā)揮整體藥效，加之中藥成分種類眾多、含量差異大，故采用單一指標(biāo)評價(jià)提取工藝優(yōu)劣具有一定的片面性，應(yīng)采用多指標(biāo)成分來進(jìn)行工藝優(yōu)化。另外，傳統(tǒng)中藥提取工藝在確定各評價(jià)指標(biāo)權(quán)重系數(shù)時(shí)通常采用主觀賦值的方法來計(jì)算綜合評分，客觀性與科學(xué)性不足。信息熵是系統(tǒng)有序程度的度量，某個(gè)屬性變異程度越大，系統(tǒng)越有序，則信息熵越小，權(quán)重系數(shù)越大;反之，則信息熵越大，權(quán)重系數(shù)小[4]。將信息熵理論應(yīng)用于系統(tǒng)評價(jià)，則可使結(jié)果不受研究者主觀影響，更具有客觀性?；诖耍狙芯坷眯畔㈧刭x權(quán)法評價(jià)千里光藥材提取工藝優(yōu)化過程中各指標(biāo)的客觀權(quán)重系數(shù)，以期提高工藝優(yōu)化的客觀性和科學(xué)性。

相關(guān)研究表明，千里光中主要有效成分為綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿等，且在6-9月份采收的藥材中上述成分的含量較高[5-6]。因此，本研究以6-9月采集的千里光藥材為研究對象，以綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿的含量為評價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)合信息熵賦權(quán)法獲得較客觀的權(quán)重系數(shù)并用以計(jì)算上述評價(jià)指標(biāo)的綜合評分，旨在優(yōu)化得到千里光的最佳提取工藝，為該藥材的進(jìn)一步開發(fā)利用提供方法參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜（HPLC）儀、Cary 100型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)（美國Agilent公司）;SG-4050C型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海碩光電子科技有限公司）;PX125DZH型電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

綠原酸對照品（批號：CHB170713，純度：≥98%）、金絲桃苷對照品（批號：CHB160904，純度：≥98%）、蘆丁對照品（批號：CHB170303，純度：≥98%）、苦參堿對照品（批號：CHB160907，純度：≥98%）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司;甲醇為色譜純，乙醇、冰醋酸等其余試劑均為分析純，水為純凈水。

千里光植物采自貴州省都勻市都勻經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)老鷹坡山坡上，采集時(shí)間為2019年6-9月，每月采集2次，每次隨機(jī)采集生長良好的完整植株5株。采集植物經(jīng)黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系中藥教研室王傳明副教授鑒定為菊科植物千里光（S. scandens Buch.-Ham.）的全草，樣本保存在黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校中藥標(biāo)本館。取不同月份采集的千里光地上部分切段，55 ℃下烘干，粉碎成粗粉后混合均勻，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取綠原酸對照品6.55 mg、金絲桃苷對照品3.27 mg，置于同一個(gè)25 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并定容，搖勻，即得綠原酸質(zhì)量濃度為0.262 0 mg/mL、金絲桃苷質(zhì)量濃度為0.130 8 mg/mL的混合對照品溶液。精密稱取蘆丁對照品8.10 mg、苦參堿對照品5.10 mg分別置于25 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為0.324 0 mg/mL的蘆丁對照品溶液和0.204 0 mg/mL的苦參堿對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 稱取千里光藥材粗粉約2 g，精密稱定，置于50 mL圓底燒瓶，加入提取溶劑后按一定的工藝條件進(jìn)行回流提取，提取液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2 綠原酸和金絲桃苷的含量測定

參照文獻(xiàn)方法[5，7]，采用HPLC法測定綠原酸和金絲桃苷的含量。

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：0.2%冰醋酸水溶液-甲醇（82 ∶ 18，V/V）;柱溫：35 ℃;流速：1.0 mg/mL;檢測波長：327 nm;進(jìn)樣量：5 μL。

2.2.2 系統(tǒng)適用性考察 取“2.1.2”“2.1.3”項(xiàng)下綠原酸和金絲桃苷混合對照品溶液和供試品溶液適量，以70%甲醇為空白對照，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，理論板數(shù)按綠原酸和金絲桃苷峰計(jì)均不低于8 000，空白對照無干擾（圖略），詳見圖1。

2.2.3 線性關(guān)系考察 參照文獻(xiàn)方法[5-8]，精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下綠原酸和金絲桃苷混合對照品溶液適量，以70%甲醇稀釋制成5個(gè)質(zhì)量濃度梯度的系列線性工作溶液（另設(shè)0 mg/mL的空白），按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，得綠原酸的回歸方程y=1 066.5x+0.786（r=0.999 3），金絲桃苷的回歸方程y=3 495.6x-0.748（r=0.999 1）。這表明綠原酸、金絲桃苷檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.026 2～0.262 0、0.013 1～0.130 8 mg/mL。

2.2.4 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法[5]進(jìn)行相應(yīng)方法學(xué)考察。結(jié)果，上述試驗(yàn)的RSD均小于1.5%（n=6），表明方法的精密度、穩(wěn)定性（室溫，36 h內(nèi)）、重復(fù)性均良好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法[7]進(jìn)行相應(yīng)方法學(xué)考察。結(jié)果，綠原酸、金絲桃苷的平均加樣回收率分別為101.25%、98.62%，RSD均小于1.5%（n=6），表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.2.6 綠原酸和金絲桃苷的含量測定 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，各樣品平行操作3次，記錄峰面積并代入“2.2.3”項(xiàng)下回歸方程分別計(jì)算綠原酸和金絲桃苷的含量。

2.3 總黃酮和總生物堿的含量測定

參照文獻(xiàn)方法[5-8]，采用紫外-可見分光光度法測定總黃酮（以蘆丁計(jì)）和總生物堿（以苦參堿計(jì)）的含量。

2.3.1 線性關(guān)系考察 參照文獻(xiàn)方法[5]，取“2.1.1”項(xiàng)下蘆丁對照品溶液各適量，分別進(jìn)行預(yù)處理，即加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻后靜置6 min;再加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻后靜置6 min;然后加入5%氫氧化鈉溶液10 mL，再用70%乙醇稀釋并定容至25 mL，搖勻，靜置15 min，制成5個(gè)質(zhì)量濃度梯度的系列線性工作溶液（另設(shè)0 mg/mL的空白），在509 nm波長處分別檢測其吸光度。參照文獻(xiàn)方法[6]，取“2.1.1”項(xiàng)下苦參堿對照品溶液各適量，以70%乙醇稀釋制成5個(gè)質(zhì)量濃度梯度的系列線性工作溶液（另設(shè)0 mg/mL的空白），在208 nm波長處分別檢測其吸光度。分別以蘆丁、苦參堿的質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)、相應(yīng)吸光度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，得蘆丁的回歸方程y=7.932 4x+0.279 9（r=0.999 4）、苦參堿的回歸方程y=29.684 87x+0.055 3（r=0.999 2）。這表明蘆丁、苦參堿檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.012 9～0.064 8、0.010 2～0.051 0 mg/mL。

2.3.2 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法[5-7]進(jìn)行相應(yīng)方法學(xué)考察。結(jié)果，上述試驗(yàn)的RSD均小于1.5%（n=6），表明方法的精密度、穩(wěn)定性（室溫，10 h內(nèi)）、重復(fù)性均良好。

2.3.3 加樣回收率試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法[5-7]進(jìn)行相應(yīng)方法學(xué)考察。結(jié)果，蘆丁、苦參堿的平均加樣回收率分別為101.13%、98.30%，RSD均小于1.5%（n=6），表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.3.4 總黃酮和總生物堿的含量測定 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液，采用紫外-可見分光光度法測定（測定總黃酮時(shí)需先按“2.3.1”項(xiàng)下方法預(yù)處理），各樣品平行操作3次，記錄吸光度并代入“2.3.1”項(xiàng)下回歸方程分別計(jì)算總黃酮和總生物堿的含量。

2.4 單因素試驗(yàn)篩選千里光提取工藝

參考文獻(xiàn)方法[8-11]，采用80 ℃水浴回流提取的方法提取千里光藥材，以綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿等4個(gè)指標(biāo)成分的含量為指標(biāo)，進(jìn)行該藥材提取工藝的單因素考察。

2.4.1 提取溶劑的選擇 稱取千里光藥材粗粉約2 g，精密稱定，平行7份，固定提取次數(shù)為2次、每次提取1.5 h，分別加入10倍量（mL/g，下同）50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇作為提取溶劑進(jìn)行回流提取。取提取液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法濾過后，取續(xù)濾液，再按“2.2”“2.3”項(xiàng)下方法分別測定綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿的含量。結(jié)果，以50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇為提取溶劑時(shí)，提取液中4種成分含量相對較高，故選擇50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇為提取溶劑進(jìn)行后續(xù)工藝優(yōu)化。

2.4.2 溶劑倍量的選擇 稱取千里光藥材粗粉約2 g，精密稱定，平行5份，分別加入5、6、8、10、20倍量的70%乙醇，回流提取2次，每次提取1.5 h。取提取液，按“2.4.1”項(xiàng)下方法處理并測定綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿的含量。結(jié)果，隨著溶劑倍量的增加，提取液中4種成分的含量逐漸上升，但以10、20倍量溶劑提取后各成分的含量差異不大，故選擇溶劑倍量為6、8、10倍進(jìn)行后續(xù)工藝優(yōu)化。

2.4.3 提取時(shí)間的選擇 稱取千里光藥材粗粉約2 g，精密稱定，平行4份，加入10倍量70%乙醇，回流提取2次，每次分別均提取0.5、1.0、1.5、2.0 h。取提取液，按“2.4.1”項(xiàng)下方法處理并測定綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿的含量。結(jié)果，當(dāng)單次提取時(shí)間為1.0、1.5、2.0 h時(shí)，提取液中4種成分含量相對較高，故選擇提取時(shí)間為1.0、1.5、2.0 h進(jìn)行后續(xù)工藝優(yōu)化。

2.4.4 提取次數(shù)的選擇 稱取千里光藥材粗粉約2 g，精密稱定，平行4份，加入10倍量70%乙醇進(jìn)行回流提取，按單次提取時(shí)間為1.5 h，分別提取1、2、3、4次。取提取液，按“2.4.1”項(xiàng)下方法處理并測定綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿的含量。結(jié)果，隨著提取次數(shù)的增加，提取液中4種成分的含量均逐漸上升，但分別提取3、4次后各成分的含量差異不大，故選擇提取次數(shù)為1、2、3次進(jìn)行后續(xù)工藝優(yōu)化。

2.5 正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化千里光提取工藝

2.5.1 因素與水平 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果并參考文獻(xiàn)方法[9-11]，對千里光的提取工藝進(jìn)一步優(yōu)化。以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、溶劑倍量（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）等4個(gè)因素為考察對象，以綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿的含量為評價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，再按“2.2”“2.3”項(xiàng)下方法測定綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿的含量。正交試驗(yàn)因素與水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

2.5.2 基于信息熵賦權(quán)計(jì)算綜合評分（M） 以綠原酸、金絲桃苷、總黃酮、總生物堿含量為評價(jià)指標(biāo)，采用信息熵賦權(quán)法對各指標(biāo)進(jìn)行賦值并計(jì)算綜合評分，參考文獻(xiàn)方法[9-11]建立原始指標(biāo)矩陣（X）如下：

2.5.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 對正交試驗(yàn)進(jìn)行極差分析。結(jié)果顯示，各因素對綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿含量綜合評分的影響程度大小排序?yàn)镈>B>C>A，即提取次數(shù)>溶劑倍量>提取時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)，詳見表2。以極差最小的因素A作為誤差項(xiàng)，進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

由表2可知，A1B2C2D2為最優(yōu)提取工藝;由表3可知，因素D對綜合評分的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其他因素?zé)o顯著性影響（P>0.05），說明提取次數(shù)對千里光藥材的綜合提取效果有顯著影響，故因素D取其最高水平值即D3（提取3次）。因此，最終確定A1B2C2D3為千里光藥材的最佳提取工藝，即加入8倍量的50%乙醇提取3次，每次1.5 h。

2.5.4 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)“2.5.3”項(xiàng)下優(yōu)化的最佳提取工藝條件，取千里光藥材粗粉適量，平行進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果，綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿含量的RSD均小于1.5%（見表4），表明優(yōu)化所得的提取工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

3.1 HPLC含量測定法中流動(dòng)相和檢測波長的選擇

本課題組分別比較了以磷酸水溶液-乙腈、磷酸水溶液-甲醇、冰醋酸水溶液-乙腈、冰醋酸水溶液-甲醇為流動(dòng)相的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以0.2%冰醋酸水溶液-甲醇（82 ∶ 18，V/V）為流動(dòng)相時(shí)，所得色譜圖的基線平穩(wěn)、分離效果好。

另外，結(jié)合文獻(xiàn)方法[4-5]，采用二極管陣列檢測器對供試品溶液進(jìn)行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在327 nm波長下的色譜圖基線相對平穩(wěn)，且綠原酸和金絲桃苷的響應(yīng)信號均較強(qiáng)，并能達(dá)到有效分離，故最終確定檢測波長為327 nm。

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)合信息熵賦權(quán)法優(yōu)化提取工藝的意義

信息熵理論具有處理復(fù)雜多量數(shù)據(jù)的優(yōu)勢，將試驗(yàn)所得的多指標(biāo)數(shù)據(jù)結(jié)果用信息熵賦權(quán)法進(jìn)行處理并計(jì)算其權(quán)重系數(shù)，進(jìn)而計(jì)算得到的綜合評分更加客觀，能更為科學(xué)地優(yōu)化提取工藝[10-11] 。本研究在單因素考察的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對千里光藥材的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，有效減少了試驗(yàn)的次數(shù);基于信息熵賦權(quán)法計(jì)算各評價(jià)指標(biāo)權(quán)重系數(shù)并此計(jì)算綜合評分，客觀、合理地反映各指標(biāo)的重要程度，篩選出了較為科學(xué)、可行的最佳工藝。對此最佳工藝進(jìn)行的3次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，4種成分含量的RSD均小于1.5%。

綜上，本研究優(yōu)化所得的提取工藝重復(fù)性好、穩(wěn)定可行，可為千里光藥材提取工藝技術(shù)參數(shù)的量化提供科學(xué)參考。

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（收稿日期：2020-02-11 修回日期：2020-05-01）

（編輯：段思怡）