王鑫純， 徐 偉， 蔣建新， 朱莉偉

(北京林業(yè)大學 材料科學與技術(shù)學院；林業(yè)生物質(zhì)材料與能源教育部工程研究中心，北京 100083)

腸道微生物菌群主要是指在人體腸道中豐富多樣地存在，同時對人體的健康和營養(yǎng)起到關(guān)鍵作用菌群的總稱。腸道微生物是人體重要的“微生物器官”，被認為是參與分解膳食纖維、氨基酸、藥物，并產(chǎn)生甲烷和維生素，同時與衰老、免疫、飲食、疾病狀況、藥物使用等諸多生理功能緊密相關(guān)[1-2]。人體腸道微生物由1 150種流行物種組成，與大鼠腸道微生物群落在分裂水平上相似，并且在大腸中可以觀察到更多的菌群多樣性[3]。野皂莢(GleditsiamicrophyllaGordon ex Y. T. Lee，GM)，屬皂莢科，落葉灌木，主產(chǎn)于太行山，生長于向陽干燥的山坡或路邊，廣泛分布于河北、河南、山西、山東、陜西等地，資源豐富。野皂莢種子中含半乳甘露聚糖約30%，并主要集中在內(nèi)胚乳部分，其含聚糖達到75%以上，其主鏈由β-1，4-糖苷鍵連接的D-吡喃甘露糖組成，支鏈由α-1，6-糖苷鍵連接的D-半乳糖組成，野皂莢半乳甘露聚糖(GMG)的甘露糖與半乳糖之比為3.18 ∶1，其水溶液為假塑性流體，在低濃度時具有高黏度，大分子在自然狀態(tài)下呈纏繞的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，常常在食品工業(yè)中用作增稠劑、持水劑，可用于冰淇淋、色拉醬、果汁、面制品等產(chǎn)品中[4-6]。多糖是人類日常攝入最豐富的飲食成分。從食材或中草藥中獲得的多糖會對腸道的生理功能產(chǎn)生重要影響，例如促進腸道脂肪的排出，促進糞便中有毒代謝物的排出，以及調(diào)節(jié)消化酶的活性等[7-9]。有研究表明低聚半乳甘露聚糖可以抑制腸道病原菌促進有益菌的繁殖、調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)代謝降低血糖、調(diào)節(jié)機體腸道功能改善便秘、增強免疫力和抗氧化能力、作為飼料添加劑、同時具有抗生素的功能等[10-15]。Badia等[16]用產(chǎn)腸毒素大腸桿菌感染豬腸道后，發(fā)現(xiàn)半乳甘露聚糖可以顯著抑制產(chǎn)腸毒素大腸桿菌在豬腸道細胞表面的粘附，表明半乳甘露聚糖具有一定的腸道保護作用。人體通過飲食攝入的大部分多糖并不能被人體胃腸道消化，但進入大腸后腸道微生物卻可以將其加以降解利用。不同碳源因其單糖組成、相對分子質(zhì)量、取代度和分支連接類型不同而影響腸道菌群的發(fā)酵速率。同時在腸道中降解程度及降解速度不同還會引起腸道微生物菌群發(fā)生不同變化，直接或間接地影響人體對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取、能量吸收以及免疫系統(tǒng)等機體反應[17]。因此，本研究以不同體積分數(shù)的H2O2對GMG進行氧化降解預處理，分析了GMG的氧化降解特性，并選用遺傳基因穩(wěn)定、安全的SD大鼠的腸道菌群模擬人體腸道體外代謝，旨在將半乳甘露聚糖進一步開發(fā)成為功能性食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

野皂莢原膠粉(含半乳甘露聚糖62.40%)，購于河北涉縣龍膠廠；SD大鼠，由北京大學醫(yī)學院動物部提供。乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸(均≥99.95%)，購于國藥集團化學試劑有限公司；過氧化氫、氯化鈉、氯化鉀、碳酸氫鈉、氯化銨、一水合硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈣、七水合硫酸亞鐵，均為分析純，購于北京化工廠；L-半胱氨酸、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母浸提物、酪蛋白、粘蛋白、膽汁鹽、刃天青和Tween 80，購于上海源葉生物有限公司。

YQX-I厭氧培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；pHS-3C型pH計；ALPHA II 傅里葉變換紅外光譜儀，德國BRUKER OPTICS；DAWN 8+多角度激光光散射儀，美國WYATT；318C+酶標儀，上海沛歐分析儀器有限公司；UV-2000型紫外-可見分光光度計，美國UNICO；Waters e2695高效液相色譜儀，美國Waters公司。

1.2 野皂莢多糖的純化

參考文獻[18]方法將野皂莢原膠粉配制成質(zhì)量分數(shù)為0.50%的均勻膠液，置于80 ℃下水合30 min。去除水不溶物后，添加無水乙醇，在15 840 r/min下離心15 min，分離沉淀。沉淀物在60 ℃下真空干燥6 h，即得純化野皂莢多糖粉末，置于干燥器中保存?zhèn)溆?。HPLC測得其含半乳甘露聚糖(88.85±3.13)%。

1.3 大鼠腸道菌群的提取

參考蔣婕等[19]報道的方法，并稍作修改。選擇SPF級別的健康雌性SD大鼠，周齡為8周，每籠4只，共10籠，25 ℃恒溫恒濕飼養(yǎng)，在無菌的環(huán)境下，收集大鼠的糞便于無菌袋中，置于-80 ℃冰箱中保存。收集7 d后，將大鼠糞便與生理鹽水按1 ∶8(g ∶mL)進行均質(zhì)化，用四層紗布過濾后，將大鼠腸道菌群懸濁液立即轉(zhuǎn)移到厭氧瓶中備用。

1.4 野皂莢多糖的體外代謝

1.4.1多糖氧化預處理 將純化野皂莢多糖粉末分別用0.3%、0.6%、1.5%、3.0%和4.5%的H2O2溶液溶解，在45 ℃下磁力攪拌反應12 h，并用乙醇沉淀。沉淀物后續(xù)處理同1.2節(jié)。不同體積分數(shù)H2O2溶液氧化降解預處理后的GMG分別標記為GMG- 0.3、GMG- 0.6、GMG-1.5、GMG-3.0和GMG- 4.5。

1.4.2培養(yǎng)基配制 培養(yǎng)基參考Di等[20]的配制方法，稍作改動。5 g胰蛋白胨、5 g蛋白胨、4.5 g酵母浸提物、4.5 g氯化鈉、4.5 g氯化鉀、3 g酪蛋白、4 g粘蛋白、1.5 g碳酸氫鈉、0.69 g一水合硫酸鎂、0.8 gL-半胱氨酸、0.5 g磷酸二氫鉀、0.5 g磷酸氫二鉀、0.4 g膽汁鹽、0.08 g氯化鈣、0.642 g氯化銨、0.005 g七水合硫酸亞鐵、4 mL 0.025%刃天青以及1 mL Tween 80定容于1 L。在121 ℃下滅菌15 min，以備使用。

1.4.3體外代謝實驗 將氧化預處理后的GMG配制成無菌多糖液，大鼠腸道菌懸液、培養(yǎng)基、無菌多糖液按體積比2 ∶2 ∶1在厭氧工作站(厭氧工作條件為V(CO2) ∶V(H2) ∶V(N2)=1 ∶2 ∶17)中渦旋均勻，模擬體外遠端盲腸糖代謝。用無氧無菌的蒸餾水作空白樣，未經(jīng)處理的GMG作對照樣，分別在0、6、12、24和48 h時進行取樣。每個樣品設3個平行組。

1.5 分析方法

1.5.1相對分子質(zhì)量測定 以葡聚糖(相對分子質(zhì)量25 500)為標準品，0.1 mol/L硝酸鈉溶液為溶劑，使用多角度激光散射檢測器(MALS)，手動進樣測定純化野皂莢多糖和H2O2氧化降解處理后的野皂莢樣品(0.20 mol/L)相對分子質(zhì)量，數(shù)據(jù)通過Astra軟件(版本6.0.2)分析[21]。

1.5.2紅外光譜分析 將純化野皂莢多糖和H2O2溶液預處理后野皂莢半乳甘露聚糖與絕干KBr充分混合、研磨、壓片，在波數(shù)為4000～400 cm-1的范圍內(nèi)，使用傅里葉變換紅外光譜分析。

1.5.3pH值測定 分別在代謝時間為0、6、12、24和48 h，吸取一定量的代謝產(chǎn)物置于冰水中20 min以停止代謝過程。使用pH計測定代謝產(chǎn)物的pH值，每個樣品平行測定3次。

1.5.4代謝產(chǎn)物的分析 將乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸制成混合液作為短鏈脂肪酸(SCFAs)和支鏈脂肪酸(BCFAs)的標準樣品，繪制標準曲線。在0、6、12、24和48 h時取出相應的培養(yǎng)瓶進行取樣，在21 756 r/min下離心5 min，取1 mL上清液過0.22 μm微孔濾膜，以5 mmol/L硫酸作為流動相、HPX-87H為色譜柱(柱溫為65 ℃)、示差折光檢測器(檢測器溫度為35 ℃，流速為0.6 mL/min)在高效液相色譜儀上進行檢測。

1.5.5糖的測定 通過苯酚-硫酸法分別測定0、6、12、24以及48 h時代謝產(chǎn)物中總糖含量[22]。采用二硝基水楊酸法分別測定0、6、12、24以及48 h時代謝產(chǎn)物中還原糖的含量[23]。

2 結(jié)果與討論

2.1 H2O2氧化降解野皂莢多糖的結(jié)構(gòu)分析

2.1.1相對分子質(zhì)量測定 H2O2的強氧化性可以將多糖的長鏈隨機斷裂，使得多糖的相對分子質(zhì)量降低[24]。本實驗中選用的GMG相對分子質(zhì)量為1 039 400，用體積分數(shù)0.3%、0.6%、1.5%、3.0%和4.5%的H2O2溶液進行氧化降解后，其產(chǎn)物GMG- 0.3，GMG- 0.6，GMG-1.5，GMG-3.0和GMG- 4.5的相對分子質(zhì)量分別為949 429、520 843、382 493、135 300和32 060。可以看出，隨著H2O2體積分數(shù)的增大，氧化降解所得產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量逐漸減小，但是H2O2氧化預處理后的野皂莢多糖相對分子質(zhì)量均在萬級以上。

2.1.2FT-IR分析 不同體積分數(shù)H2O2氧化降解GMG的紅外光譜圖見圖1。由圖1可以看出，H2O2氧化降解野皂莢多糖結(jié)構(gòu)并沒有改變。圖中3400～3300 cm-1的寬峰是多糖分子中—OH的伸縮振動峰，2930 cm-1出現(xiàn)了—CH2—的非對稱伸縮振動吸收峰，這是多糖的特征吸收峰。1660 cm-1出現(xiàn)的峰是野皂莢多糖膠所吸收的水分子的2個—OH剪切所形成的吸收峰，1146和1080 cm-1的峰為C—O伸縮振動吸收峰，870 cm-1出現(xiàn)的峰是β-吡喃糖苷鍵的特征吸收峰，810 cm-1出現(xiàn)的峰是野皂莢多糖膠骨架的伸縮振動峰。

2.2 體外代謝過程分析

2.2.1代謝過程中pH值變化 代謝過程中在腸道菌群作用下會產(chǎn)生SCFAs和BCFAs，導致發(fā)酵液的pH值下降，因此pH值是代謝過程中的重要指標之一。如圖2所示，代謝培養(yǎng)液初始pH值為7.00～7.30，隨著腸道微生物代謝反應的進行，空白組pH值基本不變，經(jīng)過H2O2預處理GMG多糖組pH值在6 h后迅速降至5.70，然后逐漸降至5.10；而未經(jīng)過H2O2預處理的GMG多糖組pH值變化相對較小。這主要是因為pH值變化與代謝產(chǎn)物中SCFAs及BCFAs的濃度相關(guān)，隨著代謝時間的變化，代謝產(chǎn)物中SCFAs和BCFAs的含量增大從而導致pH值逐漸降低[25]。多糖實驗組pH值變化趨勢基本一致。未經(jīng)過H2O2預處理的GMG代謝產(chǎn)物pH值降到5.39，而GMG- 0.3、GMG- 0.6、GMG-1.5、GMG-3.0和GMG- 4.5代謝產(chǎn)物pH值分別降到5.15、5.16、5.12、5.05和5.01。pH值的適當降低可以促進一些有益結(jié)腸微生物菌群的繁殖，并抑制一些有害微生物的繁殖[26]。

圖1 H2O2預處理前后GMG的紅外譜圖

Fig.1 FT-IR of GMG before and after pretreated by different volume fraction of H2O2solution

圖2 H2O2預處理前后GMG代謝過程中的pH值

Fig.2 pH value of metabolites of GMG before and after pretreated by H2O2

2.2.2代謝產(chǎn)物中SCFAs和BCFAs的含量變化 代謝產(chǎn)物除了pH值這個重要指標外，代謝產(chǎn)物中的SCFAs、BCFAs含量也是代謝過程中的重要指標。乙酸和丙酸是半乳糖和甘露糖分解過程的次級代謝產(chǎn)物。代謝中間物在甘露糖酶和半乳糖酶系的催化作用下生成磷酸化的半乳糖和甘露糖，在相關(guān)酶的作用下進行異構(gòu)及轉(zhuǎn)化，從而進入糖代謝途徑[27]。

當多糖被用作碳源時，產(chǎn)生的SCFAs主要是乙酸。由表1可知，未經(jīng)過H2O2預處理的GMG多糖組在6 h開始有乙酸積累，濃度為4.92 mmol/L，并隨著時間的延長濃度逐漸增加，48 h時濃度為15.89 mmol/L。而經(jīng)過預處理的GMG多糖組0到6 h之間未能檢測到乙酸，12 h開始逐漸累積，濃度在2.31～4.01 mmol/L，24 h后濃度激增至12.26～17.35 mmol/L，隨后逐漸放緩，48 h時測得GMG- 0.3、GMG- 0.6、GMG-1.5、GMG-3.0和GMG- 4.5代謝產(chǎn)物中乙酸濃度分別為21.72、25.36、21.07、21.36和15.21 mmol/L，其中GMG- 0.6代謝產(chǎn)物乙酸濃度最高。有研究表明乙酸能夠改善高血脂飲食大鼠的葡萄糖耐量和胰島素分泌，同時乙酸也是能量物質(zhì)之一，可以被結(jié)腸上皮細胞吸收，然后經(jīng)過循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到靶細胞，以提供能量[28]。

由表1可知，多糖實驗組與空白對照組在0 h已檢測到少量的丙酸，這可能是由于大鼠的盲腸內(nèi)容物中本身含有的，代謝前12 h丙酸產(chǎn)量較少，而代謝到48 h時，丙酸快速累積，濃度增加了2～3倍。未經(jīng)過預處理的GMG多糖組在0～6 h之間丙酸濃度下降，可能是由于微生物在進行大量的生理代謝活動，直至48 h時丙酸濃度為4.05 mmol/L；而經(jīng)過H2O2預處理的GMG多糖組除GMG- 4.5代謝產(chǎn)物中丙酸濃度較低外，其余的丙酸濃度差別不顯著，48 h時濃度分別為10.25、10.07、9.73、9.51和6.82 mmol/L。丙酸在脂質(zhì)代謝中具有關(guān)鍵性作用，因為丙酸可以抑制脂肪合成，可減弱與肥胖有關(guān)的炎癥和減少脂肪的生成，對脂肪組織有直接的有益影響[29]。

表1 GMG代謝不同時間代謝產(chǎn)物中SCFAs及BCFA含量變化1)

1)同列不同字母表示在不同時刻之間存在顯著差異different letters in the same column indicate that there are significant differences between different moments (p<0.05), 下表同the same as following tables

由表1可知，在整個代謝過程中正丁酸的積累略有不同，未經(jīng)過預處理GMG組在12 h時才有正丁酸積累，48 h濃度為3.96 mmol/L；而經(jīng)過H2O2預處理GMG多糖組在0～6 h時就開始了大量的代謝作用，24 h時其濃度略有波動，但到48 h時濃度明顯增加，GMG- 4.5代謝產(chǎn)物情況例外，在代謝6～48 h期間，正丁酸濃度一直在8 mmol/L左右波動。在48 h時測得5種H2O2預處理GMG代謝產(chǎn)物中正丁酸濃度分別為8.57、9.62、11.09、9.43和7.85 mmol/L。正丁酸鹽作為結(jié)腸上皮細胞的直接能量來源，具有抗炎特性，對常見的病原體有抑制作用，如產(chǎn)莢膜梭菌、沙門氏菌和壞死性腸炎等，并且能夠增強結(jié)腸環(huán)境的防御屏障，對糖尿病以及胰島素的拮抗具有有益影響[30-31]。

由表1和圖2結(jié)合來看，在0～12 h代謝期間，主要是正丁酸對總酸濃度漲幅影響較大，在12～48 h 之間，由于乙酸和丙酸的大量積累而導致總酸濃度激增。有研究表明代謝產(chǎn)物的pH值變化與代謝產(chǎn)酸類型之間有一定關(guān)系。當pH值為4～5時，趨向于乙酸的產(chǎn)生；當pH值為5～6時，趨向于丙酸的產(chǎn)生；當pH值為6～7時，趨向于丁酸的產(chǎn)生[32]。本實驗結(jié)果與該規(guī)律一致。由表1中總SCFAs濃度可以看出，多糖代謝組總SCFAs濃度均顯著高于空白對照組，并在0～48 h之間總SCFAs濃度逐漸增加，在48 h時總SCFAs濃度分別為40.54、45.05、41.89、40.29和29.88 mmol/L，GMG- 0.6所產(chǎn)生的SCFAs最多?？梢钥闯觯嗵谴x組比空白對照組代謝更劇烈。

乙酸、丙酸、正丁酸均被視為糖代謝過程中能量物質(zhì)的代謝產(chǎn)物，對健康有益。而在蛋白質(zhì)代謝過程中，會產(chǎn)生一些代謝物，若長期存在對健康非常不利，比如氨、BCFAs等。在本實驗中BCFAs僅檢測到了異丁酸，由表1可以看到，未經(jīng)過預處理的GMG多糖組在48 h代謝期間，累積的異丁酸濃度均大于1.50 mmol/L，長期積累不利于人體健康。而經(jīng)過H2O2預處理的GMG多糖組BCFAs濃度均在0～1.50 mmol/L范圍內(nèi)，GMG- 0.3、GMG- 0.6、GMG-1.5和GMG-3.0糖代謝產(chǎn)物中異丁酸濃度均為先增加后減少至0 mmol/L，而GMG- 4.5糖代謝產(chǎn)物中異丁酸濃度則是在6 h增加至1.37 mmol/L后，隨后有所降低，24 h后又趨于上升，48 h時達到1.38 mmol/L。

由于代謝過程中碳源的單糖組成、相對分子質(zhì)量、取代度和分支連接類型均會影響其代謝過程，所以通過不同體積分數(shù)的H2O2預處理后GMG的代謝過程也不同。預處理GMG實驗組中，GMG- 4.5相對分子質(zhì)量最小為32 060，其產(chǎn)生的SCFAs濃度最低為29.88 mmol/L，但其產(chǎn)生的BCFAs濃度卻在48 h 時是最高的，為1.38 mmol/L，這并不利于人體健康。而GMG- 0.6的相對分子質(zhì)量為520 843，其產(chǎn)生的SCFAs濃度最高為45.05 mmol/L，48 h時產(chǎn)生的BCFAs濃度已代謝降至0 mmol/L，有利于生物體生長代謝，對健康有益。

2.2.3代謝過程中總糖及還原糖的變化 腸道微生物在代謝過程中會產(chǎn)生一些酶，這些酶可以對代謝培養(yǎng)物中的聚糖產(chǎn)生作用，使其相對分子質(zhì)量逐漸降低，從而被腸道菌群利用。因此總糖和還原糖的濃度變化經(jīng)常被用作衡量碳水化合物代謝程度的指標之一。如表2所示，多糖實驗組中的總糖初始質(zhì)量濃度約為(0.500±0.002)g/L，經(jīng)過微生物代謝后均大幅下降。總糖在0～48 h之間變化較大，這與SCFAs和BCFAs的變化一致。GMG- 0.6代謝產(chǎn)物中總糖的消耗量最多，從(6.63±0.99)% 增加到(52.86±3.11)%。

表2 GMG代謝不同時間代謝產(chǎn)物中的總糖消耗率

表3為不同體積分數(shù)H2O2處理后的多糖代謝產(chǎn)物中的還原糖濃度。

表3 GMG代謝不同時間代謝產(chǎn)物中的還原糖質(zhì)量濃度

由表3可知，在代謝過程中，未經(jīng)過處理的GMG代謝產(chǎn)物中的還原糖濃度是逐漸下降的，可能是由于GMG不易被微生物利用；而經(jīng)過處理后的GMG其代謝產(chǎn)物中的還原糖濃度先增大后減小，結(jié)合SCFAs和BCFAs濃度變化可以看出，從0～6 h的代謝過程中，腸道菌群首先代謝容易利用的寡糖，同時分泌能夠降解半乳甘露聚糖的酶——α-半乳糖苷酶和β-甘露聚糖酶，從而產(chǎn)生更多的寡糖和還原糖，在12 h時還原糖濃度達到最大[33]。在12 h之后，腸道菌群快速將環(huán)境中游離的還原糖代謝利用。以上研究表明，GMG可以被腸道菌群很好地利用。

由圖3可以看出，GMG- 0.6代謝情況最佳，在48 h時其總SCFAs濃度和總糖消耗率均最高，分別為45.05 mmol/L和(52.86±3.11)%，表明GMG- 0.6代謝作用最劇烈。然而，GMG- 0.6相對分子質(zhì)量并不是最小，這可能是因為氧化降解過程中產(chǎn)生的寡糖數(shù)量較多，或是氧化降解使得醇沉出來多糖的取代度值較適宜，有利于腸道微生物代謝利用，并分泌大量相關(guān)酶，從而整個代謝過程較為旺盛。

圖3 GMG代謝過程中總糖(a)以及總SCFAs(b)變化趨勢Fig.3 Changes of total sugar(a) and total SCFAs(b) of GMG under metabolism

實驗結(jié)果表明：半乳甘露聚糖可以被腸道菌群利用，并且代謝產(chǎn)生大量的SCFAs，對抗炎、葡萄糖耐量、控制胰島素分泌和控制血糖等方面有一定幫助。今后研究中可以對腸道微生物菌群進行分析，闡述野皂莢半乳甘露聚糖在病理上的功能性，并進一步進行大鼠體內(nèi)代謝實驗，揭示體內(nèi)代謝機制，從而為臨床用藥等方面提供理論支撐。

3 結(jié) 論

3.1實驗將野皂莢半乳甘露聚糖(GMG)用0.3%、0.6%、1.5%、3.0%和4.5% H2O2溶液氧化降解，得到產(chǎn)物GMG- 0.3、GMG- 0.6、GMG-1.5，GMG-3.0和GMG- 4.5，與SD大鼠的腸道微生物進行培養(yǎng)，在體外模擬遠端人體盲腸利用野皂莢半乳甘露聚糖的情況。結(jié)果表明：隨著預處理H2O2體積分數(shù)的提高，GMG的相對分子質(zhì)量逐漸降低，由未處理(GMG)的1 039 400降至32 060(GMG- 4.5)，紅外光譜分析表明GMG經(jīng)H2O2氧化降解后官能團無顯著變化。

3.2不同GMG代謝產(chǎn)物的pH值差異并不顯著，除空白組外，多糖實驗組均呈現(xiàn)下降的趨勢。從SCFAs和BCFAs濃度變化來看，多糖實驗組所產(chǎn)生的各種酸濃度均顯著高于空白組，并且產(chǎn)酸類型與代謝產(chǎn)物的pH值變化有關(guān)。

3.3腸道微生物在其分泌的有關(guān)酶的作用下，可以將半乳甘露聚糖代謝利用，不同體積分數(shù)H2O2預處理GMG代謝產(chǎn)物在SCFAs和BCFAs濃度變化、總糖以及還原糖濃度之間的差異，與H2O2預處理后GMG的單糖組成、相對分子質(zhì)量、取代度不同有關(guān)。GMG- 0.6代謝情況最佳，代謝產(chǎn)生乙酸濃度最高為25.36 mmol/L，總SCFAs濃度最大為45.05 mmol/L，總糖消耗率最大為(52.86±3.11)%。