張 穎，李喜林，李致格，張富隆

(1.滁州學(xué)院 土木與建筑工程學(xué)院，安徽 滁州 239000；2.遼寧工程技術(shù)大學(xué) 土木工程學(xué)院，遼寧 阜新 123000；3.北京世源希達(dá)工程技術(shù)有限公司，北京 100080)

冶金行業(yè)的不斷發(fā)展導(dǎo)致冶金的生產(chǎn)流程較復(fù)雜，產(chǎn)生的廢水所含污染物越來(lái)越多[1]，如：軋鋼等金屬加工過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大量的酸性廢水，包括廢酸和工件沖洗水。金屬中摻加鉻會(huì)提高金屬的機(jī)械性能，這導(dǎo)致冶金行業(yè)中會(huì)有大量的鉻流失。自然界中，鉻以Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的形式存在[2，3]，其中Cr(Ⅵ)是一種毒性很大的致突、致癌劑，通常認(rèn)為其毒性要比Cr(Ⅲ)的高100倍[4]。硫酸鹽還原菌(SRB)由于其具有處理費(fèi)用低、處理污染物種類多等優(yōu)點(diǎn)而得到了廣泛的應(yīng)用[5,6]，主要通過(guò)還原SO42-消耗水合氫離子、還原生成的S2-與重金屬離子結(jié)合生成溶解度小的金屬硫化物沉淀而使水質(zhì)得到改善[7-9]。Wosiack[10]等人研究表明，SRB在厭氧條件下能有效還原廢水中的SO42-，且能使金屬離子達(dá)到有效去除。張鴻郭[11]等人研究表明固定化的硫酸鹽還原菌對(duì)廢水中Cr(VI)和SO42-的去除率分別為97.43%和99.30%。目前，國(guó)內(nèi)外研究者已將其廣泛應(yīng)用在處理含重金屬離子的工業(yè)廢水、有機(jī)廢水、城市生活廢水、酸性地浸礦山地下水、酸性礦山廢水等方面[12-14]。基于此，本實(shí)驗(yàn)從污水處理廠生化池中取得種樣，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲得可以同時(shí)有效去除冶金廢水中Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的厭氧優(yōu)勢(shì)菌屬。

與一般的回歸分析一樣，二次回歸正交設(shè)計(jì)預(yù)測(cè)值的方差隨試驗(yàn)點(diǎn)在因子空間的位置不同(各因素所取水平不同)而呈現(xiàn)較大差異[15]，因而導(dǎo)致設(shè)計(jì)不能在各個(gè)方向均提供等精度的估計(jì)，于是不能對(duì)不同試驗(yàn)點(diǎn)預(yù)測(cè)值進(jìn)行直接比較。由于誤差的干擾，就不易根據(jù)預(yù)測(cè)值尋找最優(yōu)區(qū)域[16]。為了克服這個(gè)缺點(diǎn)，本研究采用回歸旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)。回歸旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)，一方面，基本保持了回歸正交設(shè)計(jì)優(yōu)點(diǎn)，即實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、計(jì)算簡(jiǎn)便，且部分地消除了回歸系數(shù)間的相關(guān)性[17]；另一方面，能使二次回歸設(shè)計(jì)具有旋轉(zhuǎn)性。利用具有旋轉(zhuǎn)性的回歸方程進(jìn)行預(yù)測(cè)時(shí)，對(duì)于同一球面上的點(diǎn)可直接比較其預(yù)測(cè)值的好壞，從而易于找出預(yù)測(cè)值較優(yōu)區(qū)域[18]。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)選用阜新市皮革園區(qū)生化池獲得的液體菌種作為SRB的篩選樣品，基于微生物的分離鑒定及其特性研究手段，獲得優(yōu)勢(shì)SRB菌株進(jìn)而研究不同反應(yīng)條件下SRB對(duì)廢水中Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的去除效果，并通過(guò)回歸旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

菌株篩選樣品取自阜新市皮革園區(qū)生化池。實(shí)驗(yàn)所用的KNO3、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaSO4·2H2O、檸檬酸鈉、結(jié)晶紫、草酸銨、碘化鉀、孔雀綠、番紅、乙醇、重鉻酸鉀、硝酸鉻高錳酸鉀等均為分析純。

實(shí)驗(yàn)儀器：YXQ-LS-18SI型手提式壓力蒸汽滅菌鍋、HPS-280型生化培養(yǎng)箱、VD-650型超凈工作臺(tái)、XS-212型光學(xué)顯微鏡、pHS-3C型精密pH計(jì)、TG-328A型電子天平、UV756PC型721分光光度計(jì)。

富集培養(yǎng)基的配置：KNO31 g/L，Na2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5 g/L，CaSO4·2H2O 0.5 g/L，蛋白胨1 g/L，酵母膏1 g/L，檸檬酸鈉3 g/L，蒸餾水1 L，pH=8，121℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基：在富集培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂。121℃滅菌20 min。

模擬冶金酸性廢水的配置：Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的濃度分別為50 mg/L、10 mg/L、500 mg/L，溶液pH=5。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定方法

利用二苯碳酰二肼分光光度法測(cè)定Cr(VI)。高錳酸鉀氧化-二苯碳酰二肼分光光度法測(cè)定Cr(Ⅲ)。鉻酸鋇分光光度法測(cè)定SO42-，玻璃電極法測(cè)定pH。

1.2.2 菌株馴化、篩選和分類方法

對(duì)菌株進(jìn)行耐鉻能力馴化，使菌株能夠在含有Cr(VI)和Cr(Ⅲ)的廢水中生長(zhǎng)。最初階段先加入濃度為10 mg/L的Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)，使細(xì)菌逐漸適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境，一周后加大Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)投加量，以后每周依次加入50、80、120、150、200、250、300、350、400、450、500 mg/L，使其能夠逐漸適應(yīng)高濃度的環(huán)境；稀釋涂布-疊皿夾層法對(duì)SRB純化分離；鏡檢法對(duì)SRB進(jìn)行鑒定。

1.2.3 SRB處理廢水的方法

取6份200 mL配置好的含Cr(VI)50 mg/L、Cr(Ⅲ)10 mg/L、SO42-500 mg/L的水樣，調(diào)節(jié)pH=7，分別加入不同體積比的處于對(duì)數(shù)期的經(jīng)過(guò)馴化、分離SRB(細(xì)菌計(jì)數(shù)得到菌液對(duì)數(shù)期的菌密度為3×108個(gè)/mL)，置于35℃厭氧培養(yǎng)箱中充分反應(yīng)24 h后，將其置于離心機(jī)轉(zhuǎn)速為4000 r/min條件下，離心處理30 min，取上清液測(cè)定Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-濃度，并計(jì)算其去除率，確定最佳SRB投加量。以同樣的方法分別控制不同pH、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度，測(cè)定Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-濃度，確定最佳反應(yīng)pH、時(shí)間和溫度。

1.2.4 去除率的計(jì)算方法

按照上述方法測(cè)定在不同SRB投加量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度條件下，處理后的冶金廢水中Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的濃度，并通過(guò)式(1)計(jì)算出各個(gè)污染物的去除率。

(1)

式中：y：去除率，100%；

c1：處理前污染離子的濃度，mg/L；

c2：處理后污染離子的濃度，mg/L。

1.2.5 正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方法

選取SRB投加量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度3因素，展開(kāi)3因素正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，對(duì)SRB處理酸性冶金廢水中鉻的效果進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)因素水平進(jìn)行編碼，結(jié)果見(jiàn)表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)的因素水平編碼表

*Z1SRB投加量；Z2反應(yīng)時(shí)間；Z3反應(yīng)溫度

2 結(jié)果與分析

2.1 SRB分離純化及馴化鑒定結(jié)果

采用疊皿-夾層培養(yǎng)法對(duì)馴化后的耐鉻細(xì)菌進(jìn)行純化分離，在35 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d時(shí)菌落形態(tài)如圖1所示。這是因?yàn)榱蛩猁}還原菌代謝產(chǎn)生的H2S與培養(yǎng)基中的Fe2+反應(yīng)生成黑色FeS沉淀所致[19]。選取形態(tài)單一的菌落置于滅菌消毒處理后的培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)5 d后，溶液變?yōu)槟?，并產(chǎn)生大量的臭雞蛋氣味的氣體，說(shuō)明SRB已經(jīng)適應(yīng)環(huán)境，能夠在500 mg/L的高濃度含鉻廢水中存活。

圖1 細(xì)菌的富集培養(yǎng)圖

在1600倍油鏡下鏡檢革蘭氏染色和經(jīng)番紅復(fù)染的芽孢染色的結(jié)果分別如圖2a、2b所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SRB均被染為紅色，所以初步判斷該菌屬無(wú)芽孢、呈陰性；在1600倍的油鏡下觀察到的細(xì)菌的鞭毛染色結(jié)果由圖3a所示，可知菌株是極生鞭毛；純化后的SRB透射電鏡放大30000倍的檢測(cè)結(jié)果如圖3b所示，可明顯看出該菌株呈桿狀，且具有鞭毛。

a.革蘭氏染色圖 b.芽孢染色圖

圖2細(xì)菌染色結(jié)果圖

a.鞭毛染色圖 b.透射電鏡檢測(cè)圖

圖3細(xì)菌鏡檢結(jié)果圖

分別將菌株在好氧和厭氧條件下培養(yǎng)3 d后進(jìn)行基因測(cè)序，得到兩種條件下培養(yǎng)菌株的DNA測(cè)序結(jié)果相同，說(shuō)明培養(yǎng)的菌株屬于兼性厭氧菌。通過(guò)對(duì)該菌株的基因測(cè)序以及通過(guò)BLAST基因庫(kù)比對(duì)、序列同源性分析可看出，該兼性厭氧菌與Citrobacter amalonaticus TB10的相似性最高，相似度達(dá)99.93%，說(shuō)明該菌株與Citrobacter amalonaticus TB10屬于同一性質(zhì)的菌株，均為檸檬酸性桿菌。并利用MEGA 6.0軟件得到所測(cè)菌株序列與其他物質(zhì)的親緣關(guān)系，得到的進(jìn)化樹結(jié)果如圖4所示。

圖4 菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 SRB對(duì)冶金酸性廢水去除效果

2.2.1 SRB投加量對(duì)污染物去除率的影響

不同體積比的SRB條件下對(duì)Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的去除效果如圖5所示?？煽闯觯珻r(VI)、Cr(Ⅲ)、SO42-的去除率均隨著SRB投加量的增加逐漸增大，在SRB投加體積比為1.5%時(shí)，Cr(Ⅲ)的去除率較低為9.5%，Cr(VI)的去除率較高為67.8%，這是由于SRB將溶液中的Cr(VI)還原為大量的Cr(Ⅲ)，使溶液中Cr(Ⅲ)的濃度增大，而當(dāng)SRB菌足夠多為3%時(shí)，Cr(VI)、Cr(Ⅲ)、SO42-的去除率分別為95.8%、68.7%、70.8%，這是因?yàn)镾RB將溶液中的Cr(VI)還原Cr(Ⅲ)，將SO42-還原為S2-，S2-與Cr(Ⅲ)發(fā)生雙水解反應(yīng)，生成Cr(OH)3沉淀，使得Cr(Ⅲ)的濃度降低。當(dāng)SRB投加量繼續(xù)增大時(shí)，去除率增加不明顯，綜合考慮確定最佳的投加量為3%。

圖5 SRB投加量對(duì)污染物的去除影響

2.2.2 初始pH對(duì)污染物去除率的影響

不同pH條件下對(duì)Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的去除效果如圖6所示?？煽闯?，隨著pH的逐漸增大，Cr(Ⅲ)的去除率逐漸增大，而Cr(VI)、SO42-的去除率在pH>7時(shí)逐漸下降，在pH=7時(shí)去除率最大，分別為95.8%、70.8%，說(shuō)明SRB為中性菌，在pH值為7時(shí)活性最好；Cr(Ⅲ)隨著pH增大一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且在pH>7時(shí)上升的更快，這是因?yàn)閜H>7溶液中Cr(VI)被還原成Cr(Ⅲ)的量少，而溶液中Cr(Ⅲ)除了與S2-發(fā)生雙水解反應(yīng)，還可以與溶液中的OH-形成沉淀，所以去除率較大。

圖6 pH值對(duì)污染物的去除影響

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)污染物去除率的影響

不同反應(yīng)時(shí)間下SRB對(duì)Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的去除效果如圖7所示?？煽闯?，在反應(yīng)進(jìn)行0.5 d～2.5 d時(shí)，對(duì)Cr(VI)、SO42-的去除率由10.8%增加到95.2%，對(duì)Cr(Ⅲ)的去除率由7.9%增加到67.2%，對(duì)SO42-的去除率由16.7%增加到68.4%，可見(jiàn)，該階段的SRB處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，隨著接觸時(shí)間的增長(zhǎng)，反應(yīng)進(jìn)行的越完全。在反應(yīng)進(jìn)行3d時(shí)Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的去除率即可達(dá)到最大，分別為95.8%、68.7%、70.8%。

圖7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)污染物的去除影響

2.2.4 反應(yīng)溫度對(duì)污染物去除率的影響

不同反應(yīng)溫度下SRB對(duì)Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的去除效果如圖8所示?？煽闯?，Cr(VI)、Cr(Ⅲ)、SO42-的去除率在溫度為35℃時(shí)達(dá)到最大值，分別為95.8%、68.7%、70.8%，說(shuō)明SRB受溫度影響，35℃可使SRB保持最佳的活性，溫度過(guò)高或者過(guò)低會(huì)影響到SRB的活性，導(dǎo)致Cr(VI)和SO42-的還原量減少，Cr(VI)還原為Cr(Ⅲ)的量雖然減少，但是Cr(Ⅲ)的去除率也較低，是因?yàn)镾O42-的還原量少使得生成的S2-量也少，從而S2-與Cr(Ⅲ)發(fā)生雙水解的量也少，所以最佳的反應(yīng)溫度為35℃。

圖8 溫度對(duì)污染物的去除影響

2.3 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)對(duì)污染物去除條件優(yōu)化

建立SRB處理冶金酸性廢水中鉻實(shí)驗(yàn)的三元二次正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)回歸方程，得到Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的去除率結(jié)果見(jiàn)表2所示。

表2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

*ya-SO42-去除率；yb-Cr(Ⅵ)去除率；yc-Cr(Ⅲ)去除率

經(jīng)過(guò)二次方差分析剔除不顯著項(xiàng)后，結(jié)果顯示各項(xiàng)均達(dá)到顯著水平，最后確定SO42-、Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的回歸方程分別為：

(2)

(3)

(4)

在3個(gè)實(shí)驗(yàn)因素的編碼范圍[-1.682,1.682]內(nèi)，通過(guò)Excel規(guī)劃求解，得到：當(dāng)x1=3.3，x2=3.4，x3=34，即SRB投加量為3.3%、反應(yīng)時(shí)間為3.4 d、反應(yīng)溫度為34 ℃時(shí)，SO42-、Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的去除率分別可達(dá)到理論值69.78%、100%、65.46%。

3 結(jié)論

(1)通過(guò)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行純化培養(yǎng)以及革蘭氏染色、芽孢染色、鞭毛染色、TEM分析、基因測(cè)序等鑒定手段，得到該菌株無(wú)芽孢、有鞭毛、為檸檬酸性桿菌、生化類型為兼性厭氧型。

(2)SRB處理200 mL含Cr(VI)、Cr(Ⅲ)、SO42-的冶金酸性廢水結(jié)果發(fā)現(xiàn)：SRB菌懸液體積比為3%(細(xì)菌計(jì)數(shù)得到菌液的菌密度為3×108個(gè)/mL)、pH=7、反應(yīng)溫度為35℃、反應(yīng)進(jìn)行3 d時(shí)，對(duì)Cr(VI)、Cr(Ⅲ)、SO42-的去除率分別為95.8%、68.7%、70.8%，說(shuō)明該菌株為耐鉻、嗜中溫、中性菌。

(3)回歸正交旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)對(duì)SRB處理冶金酸性廢水的條件優(yōu)化結(jié)果表明：當(dāng)SRB投加體積比3.3%(細(xì)菌計(jì)數(shù)得到菌液對(duì)數(shù)期的菌密度為3×108個(gè)/mL)、反應(yīng)時(shí)間為3.4 d、反應(yīng)溫度為34 ℃時(shí)，Cr(VI)、Cr(Ⅲ)、SO42-的去除率分別可達(dá)到理論值100%、65.46%、69.78%。