王鼎豪，劉 宇，國 穎，江 皓，汪貴斌

（南京林業(yè)大學 a.南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心；b.林學院，江蘇 南京 210037）

銀杏Ginkgo biloba是中生代孑遺的稀有樹種，為我國特有樹種[1]。銀杏葉中含有多種具有重要藥理活性的次生代謝產(chǎn)物，其中黃酮類化合物是主要活性成分之一，它不僅廣泛參與植物的各項生命活動，還對人體具有抗氧化、提高免疫力、擴展或收縮血管、降低血脂、抗炎癥等療效[2-3]，在制藥行業(yè)有著廣泛的應用。有研究結(jié)果表明，外源激素處理會對植物黃酮類化合物的合成與積累產(chǎn)生重要影響。Park 等[4]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的生長素（IAA）和赤霉素（GA）處理可以促進蕎麥Fagopyrum esculentum芽中類黃酮的積累。在酸橙Citrus aurantium葉片上噴施GA 和水楊酸（SA）后，酸橙葉片中總酚和總黃酮含量顯著上升[5]。對黃柏Phellodendron chinense噴施外源 6-芐氨基嘌呤（6-BA）和α-萘乙酸（NAA）后，葉片中的類黃酮物質(zhì)等藥用成分含量顯著增加[6]。

目前，有關(guān)激素與銀杏次生代謝物的研究多集中在內(nèi)源激素與黃酮含量的關(guān)系或外源激素處理對銀杏愈傷組織中次生代謝物積累的影響等方面[7-8]。通過對銀杏植株噴施特定的激素來提高其葉內(nèi)目標次生代謝物含量的研究報道較為鮮見，尤其是進行田間試驗的研究。本研究中選用4 種可調(diào)節(jié)植物次生代謝的激素處理同一銀杏品種，測定激素處理后銀杏葉中黃酮的含量及其組成，分析激素種類、濃度及處理后時長與黃酮類化合物含量之間的關(guān)系，以期為提高銀杏葉用林的產(chǎn)量和質(zhì)量提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于南京林業(yè)大學白馬教學科研基地（31°36′N，119°10′E）。該地屬亞熱帶季風氣候，年平均氣溫15.5 ℃，年平均日照2 146 h，年平均降水1 037 mm。試驗地土壤理化性狀良好，占地約500 m2，約有300 棵銀杏樹，均為10年生實生樹，樹高2.5 ～3.0 m，地徑6 ～8 cm，株行距1.5 m，株間距1 m。

1.2 試驗設計

采用完全隨機試驗設計，使用6-BA、GA、NAA、PP333共4 種激素，每種激素處理設置3 個濃度梯度，以乙醇溶液處理為對照（CK），共計13 個處理（表1）。先將粉狀激素溶解于95%無水乙醇，再用蒸餾水分別稀釋至所需濃度，其中酒精體積分數(shù)為5%，Tween 20 體積分數(shù)為0.02%，對照組噴施等量體積分數(shù)的乙醇（含0.02%的Tween 20）。

表1 各處理中所使用激素種類及其質(zhì)量濃度Table 1 Types of hormones used in treatments and their mass concentrations mg/L

在試驗地內(nèi)選擇生長旺盛、長勢一致的銀杏樹掛牌，每個處理隨機分配9 株（為9 個生物學重復），共計處理117 株。將各處理的激素溶液分別噴施在銀杏葉上，直至處理葉片全部濕潤，每株樹噴施量約220 mL，各處理噴施量為2 000 mL。

1.3 樣品采集和處理

2019年5月9 日16:00，使用各處理溶液噴施葉片，之后每隔5 d 采集1 次葉片，共采集4 次。采樣時間為9:00（天氣晴朗）。為了減少誤差，采集每株樹朝南方向枝條的頂部、中部、基部的全展葉片1 ～2 片，將各部位葉片混合后用冰盒保存，立即帶回試驗室。將不同處理的葉片分別放入信封，105 ℃殺青10 min 后，置于60 ℃烘箱烘干至恒質(zhì)量，用粉碎機將干葉磨成粉，稱0.5 g用9 cm 定圈濾紙包好，每個處理包3 份，待提取。

1.4 黃酮提取和測定[9]

采用索氏提取法提取黃酮：粉包加入石油醚后，在索氏提取器上回流3 h 進行除雜，之后加甲醇回流4 h，將提取液旋蒸，蒸干后用25 mL 色譜甲醇和25%鹽酸溶液（4∶1）分批洗脫內(nèi)壁，再回流0.5 h 后用色譜甲醇定容到25 mL，溶液保存待測。

采用高效液相色譜法（HPLC），使用Waters arc 二元高效液相色譜儀測定黃酮含量。以甲醇和0.1%磷酸溶液（54∶46）為流動相，檢測波長為360 nm。理論板數(shù)按槲皮素峰計算，應不低于2 500。測定并計算槲皮素含量（C槲皮素）、山奈酚含量（C山奈酚）、異鼠李素含量（C異鼠李素），換算總黃酮含量（C總黃酮）。

C總黃酮=(C槲皮素+C山奈酚+C異鼠李素)×2.51。

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

采用Excel 2016 和SPSS 25.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，用Graphpad Prism 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素種類和濃度對銀杏葉槲皮素含量的影響

不同種類及濃度激素處理后銀杏葉槲皮素的含量及其多重比較結(jié)果見表2。由表2 可知，使用20 mg/L 6-BA 處理后不同采樣時間的葉槲皮素含量均顯著提高（P＜0.05），且達到了各采樣時間的最高值，與對照相比，分別提高了60.3%、42.5%、18.1%和47.7%，在處理后10 d 時達到最大值2.112 mg/g。較低質(zhì)量濃度的6-BA（20 mg/L） 促進葉片槲皮素含量提高且見效快，處理后5～10 d 時有明顯效果，高質(zhì)量濃度的6-BA（50、80 mg/L）在處理后15 d 內(nèi)，反而抑制了葉中槲皮素的積累，處理后20 d 時含量有所提升。

表2 不同種類及濃度激素處理后銀杏葉槲皮素的含量? Table 2 Quercetin contents in G.biloba leaves treated by different types and concentrations of hormones mg/g

50、80 mg/L GA 處理促進了葉片槲皮素含量的提高且見效快，處理后5 d 時即有明顯效果，處理后各采樣時間的槲皮素含量與對照相比均有所增加，50 mg/L GA 處理相對提高更多，與對照相比各采樣時間分別提高了24.6%、25.7%、2.4%和43.0%。而低質(zhì)量濃度GA（20 mg/L）處理后15 d內(nèi)顯著抑制了葉片中槲皮素的積累，處理后20 d時槲皮素含量比對照顯著提高。

經(jīng)NAA 處理后，除50 mg/L NAA 處理后10 d 時和80 mg/L NAA 處理后5 d 時葉片槲皮素含量比對照有所下降外，其他處理和采樣時間的槲皮素含量均顯著高于對照。20 mg/L NAA 處理后，各采樣時間的葉槲皮素含量與對照相比均顯著增加，80 mg/L NAA 處理后10 ～20 d 時比對照分別提高了12.0%、37.4%和88.3%，在處理后15 d 時達到最大值2.532 mg/g。

經(jīng)PP333處理后，100 mg/L PP333處理提高了在不同時間采樣的葉中槲皮素含量，與對照相比分別提高了25.4%、7.5%、3.3%和32.7%，在處理后20 d 時達到最大值1.785 mg/g。而50、100 mg/L PP333處理后15 d 內(nèi)，葉中槲皮素的含量有不同程度的降低，處理后20 d 時比對照顯著提高。

2.2 激素種類和濃度對銀杏葉山奈酚含量的影響

不同種類及濃度激素處理后銀杏葉山奈酚的含量及其多重比較結(jié)果見表3。由表3 可知，經(jīng)不同濃度6-BA 處理后，各采樣時間銀杏葉中山奈酚含量差異均達到顯著水平，其中50 mg/L 6-BA 處理提升效果最大，與對照相比分別提高了105.1%、47.8%、41.5%和32.6%。提升效果隨采樣時間延后而逐漸降低。見效快，在處理后5 d 時達到最大值1.782 mg/g。

表3 不同種類及濃度激素處理后銀杏葉山奈酚的含量 Table 3 Campherol contents in G.biloba leaves treated by different types and concentrations of hormones mg/g

葉片經(jīng)50 mg/L GA 處理后，除在處理后10 d 時山奈酚含量相比對照減少了1.9%外，其他采樣期內(nèi)山奈酚含量均顯著高于對照，分別提高了41.0%、26.4%和27.6%，并在處理后20 d 時達到最大值1.481 mg/g。20 mg/L GA 處理不同采樣時間的提高效果與50 mg/L GA 處理一致，但提高量均低于50 mg/L GA 處理。80 mg/L GA 處理后各采樣時間葉中槲皮素含量均有所提高。GA 處理并經(jīng)10 d 后，山奈酚含量提高較少，甚至出現(xiàn)降低，與其他采樣時間的情況相反。

葉片經(jīng)NAA 處理后，山奈酚含量均有不同程度的提高，尤其是50、80 mg/L NAA 處理后，各采樣時間的葉山奈酚含量與對照相比均有顯著性提高。50 mg/L NAA 處理中 ，各采樣時間的山奈酚含量與對照相比分別提高了45.9%、87.4%、81.2%和138.2%，在處理后20 d時達到最大值2.765 mg/g。 80 mg/L NAA 處理中，各采樣時間的山奈酚含量與對照相比分別提高了65.0%、42.7%、119.0%和99.1%。NAA 提高葉中山奈酚含量見效快，處理后15 ～20 d 時效果最明顯。

葉片經(jīng)PP333處理后，除150 mg/L PP333處理后10 d 時抑制了山奈酚含量，其他處理均不同程度提高了不同采樣時間葉中山奈酚含量。經(jīng)50 mg/L PP333處理后，各采樣時間的山奈酚含量與對照相比均有顯著性提高，分別提高了30.5%、11.8%、21.1%和39.4%，在處理后20 d 時達到最大值1.618 mg/g。不同濃度PP333處理15 d 后葉中山奈酚含量均顯著提高。

2.3 激素種類和濃度對銀杏葉異鼠李素含量的影響

不同種類及濃度激素處理后銀杏葉異鼠李素的含量及其多重比較結(jié)果見表4。由表4 可知，葉片經(jīng)6-BA 處理后，在大多采樣時間異鼠李素含量低于對照，僅20 mg/L 6-BA 處理后15 d、50 mg/L 6-BA 處理后5 d 和80 mg/L 6-BA 處理后10 d 時顯著高于對照。

表4 不同種類及濃度激素處理后銀杏葉異鼠李素的含量 Table 4 Isorhamnetin contents in G.biloba leaves treated by different types and concentrations of hormones mg/g

葉片經(jīng)GA 處理后，各采樣期內(nèi)異鼠李素含量均有不同程度提高，其中80 mg/L GA 能顯著提高葉片中異鼠李素含量，各采樣期相比對照分別提高了38.6%、39.2%、55.3%和48.9%，在處理后15 d 時達到最大值0.528 mg/g。GA 在處理后15 ～20 d 時對葉中異鼠李素含量提升最大，且隨著濃度提高，異鼠李素含量也有提高。

葉片經(jīng)80 mg/L NAA 處理后，除在處理后5 d 時表現(xiàn)為抑制外，其他采樣期內(nèi)異鼠李素含量均顯著高于對照，相比對照分別提高了109.3%、42.1%和136.9%，在處理后20 d時達到最大值0.789 mg/g， 20、50 mg/L NAA 在各采樣期內(nèi)均顯著提高了異鼠李素含量。NAA 對葉中異鼠李素含量的提升在處理后5 ～10 d 時即見效，在處理后15 ～20 d時異鼠李素含量達最大。

葉片經(jīng)100 mg/L PP333處理后，各采樣期內(nèi)異鼠李素含量均高于對照，分別提高了17.4%、2.1%、2.6% 和17.1%，在處理后20 d 時達到最大值 0.390 mg/g。而50、150 mg/L PP333對葉內(nèi)異鼠李素含量產(chǎn)生了抑制效果，處理后5 ～15 d 時抑制作用顯著。

2.4 激素種類和濃度對銀杏葉總黃酮含量的影響

不同種類及濃度激素處理后銀杏葉總黃酮的含量及其多重比較結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可見，葉片經(jīng)處理后，低質(zhì)量濃度6-BA（20 mg/L）顯著提高了葉中總黃酮含量，且見效快，在處理后15 d 時出現(xiàn)最大值。50 mg/L 6-BA 處理的提升效果不如20 mg/L 6-BA 處理，在處理后10 d 時總黃酮含量甚至低于對照。80 mg/L 6-BA 處理對各采樣時間葉中總黃酮含量的提升效果均低于20 mg/L 6-BA 處理。

葉片經(jīng)GA 中處理后，高質(zhì)量濃度的GA（50、80 mg/L）處理中各采樣時間的葉中總黃酮含量比對照均有提高，且見效快，在處理后20 d 時出現(xiàn)最大值。而低質(zhì)量濃度的GA（20 mg/L）處理在處理后15 d 內(nèi)抑制了葉中總黃酮含量。

不同濃度的NAA 均顯著提高了不同采樣時間的銀杏葉總黃酮含量，且見效快。處理后5 d 時，低質(zhì)量濃度的NAA（50 mg/L）提升效果優(yōu)于高質(zhì)量濃度的NAA（100、150 mg/L），而處理后10 ～20 d 時正好相反，且葉中總黃酮含量隨采樣時間延后而逐漸提高，在處理后20 d時出現(xiàn)最大值。

100 mg/L PP333處理中各采樣時間的葉總黃酮含量相比對照均有提高，并在處理后20 d 時出現(xiàn)最大值。50、150 mg/L PP333處理后15 d 內(nèi)，葉中總黃酮含量提升不明顯，甚至出現(xiàn)降低。處理后20 d 時各濃度PP333處理均顯著提高了葉中總黃酮含量。

3 結(jié)論與討論

可以通過采取多種措施來提高銀杏葉用林銀杏葉的產(chǎn)量和質(zhì)量，如水分調(diào)控、營養(yǎng)調(diào)控、樹體調(diào)控等，激素調(diào)控也是一種重要的栽培措施。本研究結(jié)果表明，6-BA、GA、NAA 和PP333有促進銀杏葉黃酮類化合物積累的效果，但黃酮類化合物含量的提高幅度受激素種類、激素濃度和處理時間等因素影響。在本試驗環(huán)境下，6-BA、GA、NAA 和PP333提高銀杏葉黃酮類化合物含量的最適宜質(zhì)量濃度分別為20、50、20 和100 mg/L。 在生產(chǎn)實踐中，需根據(jù)各地的具體環(huán)境條件、銀杏葉用林的生長狀況等進一步進行試驗，并在周邊進行推廣。

圖1 不同種類及濃度激素處理后銀杏葉總黃酮的含量Fig.1 Total flavonoids contents in G.biloba leaves treated by different types and concentrations of hormones

植物生長調(diào)節(jié)劑在植物生長發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用。6-BA 屬于細胞分裂素，在次生代謝產(chǎn)物的合成和積累以及應激反應過程中發(fā)揮著重要的作用[10]。本試驗結(jié)果表明，相對低質(zhì)量濃度的6-BA（20 mg/L）是提高銀杏葉總黃酮含量的最適宜濃度，各采樣時間的銀杏葉總黃酮含量顯著增高，并且葉中槲皮素、山奈酚含量也顯著提高，其原因是可能較低濃度的6-BA 溶液提高了葉片中細胞分裂素的水平，抑制并清除了自由基，增強了光合作用[11]，從而促進了黃酮的合成和積累。有研究結(jié)果表明，外源6-BA 處理下甘草Glycyrrhiza uralensis中黃酮類物質(zhì)含量提高[12]，6-BA 對三裂葉野葛Pueraria phaseoloides毛狀根中異黃酮化合物的積累具有重要的調(diào)控作用，與本研究結(jié)果一致[13]。

GA 是種能夠加速細胞分裂與伸長，促進植株生長，抑制植物器官衰老的植物生長調(diào)節(jié)劑[14]。本試驗結(jié)果表明，對葉片噴施50、80 mg/L GA 后，各采樣時間的銀杏葉總黃酮含量均有不同程度的提升，并且槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量基本均有所提高。這可能與GA 誘導了DELLA 蛋白降解有關(guān)[15]，而且GA 已被證實是生長素運輸所必需的激素[16]，兩者均證實了GA 對植物生長有較好的促進效果。另有研究結(jié)果表明，噴施GA 后，黃芩Scutellaria baicalensis中苯丙氨酸途徑的產(chǎn)物木質(zhì)素和黃酮類成分累積量上升[17]，這些因素均有利于次生代謝物黃酮的合成。不同濃度的GA處理除了能影響苦蕎Fagopyrum tataricum的產(chǎn)量，還對其籽粒中的黃酮含量存在影響[18]。噴施GA可提升葡萄Vitis vinifera所有組織中單萜和倍半萜的合成，并可提升葡萄葉片中類黃酮的含量[19]。

NAA 能促進細胞分裂和擴大，被廣泛應用于植物組織培養(yǎng)中，有研究結(jié)果表明它有利于銀杏莖段愈傷組織的誘導[20]。本試驗結(jié)果表明，噴施20、50、80 mg/L NAA 均會顯著提升各采樣時間的銀杏葉中總黃酮含量，但NAA 處理后5 d 時，受處理葉片出現(xiàn)了明顯的黃化和萎蔫現(xiàn)象，NAA濃度越高，經(jīng)過時間越長，黃化和萎蔫現(xiàn)象越嚴重。這種現(xiàn)象表明，噴施高濃度的NAA 對銀杏葉造成了較強的逆境脅迫，而黃酮含量會因為脅迫增強而提高[21]，但是噴施高濃度的NAA 不利于銀杏葉片及植株的良性發(fā)育。本研究結(jié)果表明，NAA 提升銀杏葉黃酮含量的適宜噴施質(zhì)量濃度是20 mg/L。 崔剛等[22]在銀杏組織培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，低質(zhì)量濃度激素NAA（0.1 mg/L）與6-BA（0.5 mg/L）更有助于銀杏胚愈傷組織中黃酮的積累，與本試驗結(jié)果一致。

多效唑有延緩植物生長，抑制莖稈伸長，增加植物抗逆性能，提高產(chǎn)量等效果[23]。本試驗結(jié)果表明，100 mg/L PP333處理對不同采樣時間的葉片中槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量均有促進效果。有研究結(jié)果表明，多效唑的作用時間較長，施用1 次足量的多效唑，可以影響秧苗的整個生長過程，多次施多效唑則有累加效應[24]。本試驗中數(shù)據(jù)顯示，多效唑處理后15 d 內(nèi)（除100 mg/L處理）銀杏葉總黃酮含量并無顯著增加，但噴施不同濃度多效唑20 d后總黃酮含量均有顯著增加。多效唑噴施油菜Brassica napus的試驗結(jié)果表明，多效唑能增加葉綠素含量，從而提升光合效率，提高可溶性糖和相關(guān)合成酶的含量[25]，這些因素均可能與銀杏葉黃酮含量提高有關(guān)。三七Panax notoginseng苗期噴施多效唑，對葉中葉綠素合成和塊根中總黃酮的積累具有促進作用，低濃度多效唑的促進作用不顯著，高濃度多效唑的促進作用明顯[26]。

不同外源激素影響植物次生代謝的效果和時間存在差異[4-6]，銀杏葉黃酮含量年動態(tài)變化明顯，試驗周期越長，氣候等因素影響越大[27-28]。通常外源激素處理對銀杏次生代謝物產(chǎn)生影響的時間較短[22]，因此本研究中將試驗周期定為20 d。另有研究結(jié)果表明，9月銀杏葉黃酮含量較高，是采收藥用銀杏葉的主要時間[27]。在采收前噴施外源激素對提高銀杏葉的藥用價值具有重要意義，這4種外源激素對銀杏葉黃酮含量的長期影響以及采收前的噴施效果有待進一步研究。

本研究中發(fā)現(xiàn)4 種外源激素6-BA、GA、NAA和PP333的濃度和處理時間對銀杏葉黃酮含量的短期影響效果明顯，但這4 種激素對銀杏葉的生長發(fā)育、內(nèi)源激素含量變化等產(chǎn)生的作用尚不明確，這些因素與植物次生代謝物含量變化緊密相關(guān)[29-31]。 除了黃酮，萜內(nèi)酯含量也是衡量銀杏葉價值的重要指標，因此這4 種外源激素的濃度和處理時間對銀杏葉生理生化特性變化的影響，及其導致黃酮和萜內(nèi)酯含量變化的分子機制均有待進一步深入研究。