趙瓊玲，張永輝，羅會(huì)英，金 杰，何 璐，袁建民， 瞿文林，沙毓滄

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 a.熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，云南 元謀 651300；b.園藝作物研究所，云南 昆明 650001； 2.元謀干熱河谷植物園，云南 元謀 651300）

余甘子Phyllanthus emblica為大戟科葉下珠屬植物，又名滇橄欖，其果實(shí)入口苦澀，回味甘甜，故名“余甘”。余甘子果實(shí)性涼，味甘，酸澀，具有清熱涼血、消食健胃、生津止渴的功效。臨床醫(yī)學(xué)研究結(jié)果證明，余甘子果實(shí)具有抗腫瘤，抗衰老[1]，抗病原微生物，降血脂和血壓，促使排鉛，治療糖尿病，控制和治療膽道疾病[2]，消炎消毒，止瀉止痛，治療血熱血淤、消化不良、腹脹、咳嗽、喉痛、口干[3]的作用，是衛(wèi)生部審核頒布的“藥食同源”植物[4]。

余甘子果實(shí)富含酚酸類化合物（沒(méi)食子酸、單寧）[5]、黃酮[6]、多糖、維生素C、SOD、氨基酸等成分，營(yíng)養(yǎng)豐富。目前，余甘子果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分的形成及積累變化機(jī)制已成為種質(zhì)資源學(xué)及藥食同源植物研究的熱點(diǎn)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，余甘子果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分的形成及積累變化與來(lái)源地有關(guān)。陳曉蘭等[7]比較了不同產(chǎn)地余甘子果實(shí)的多糖含量，發(fā)現(xiàn)廣州余甘子果汁中多糖含量最高；趙瓊玲等[8]對(duì)余甘子成熟果實(shí)氨基酸組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源的余甘子果實(shí)的氨基酸組成和含量有較大差異。另一方面，余甘子果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分的形成及積累變化與其成熟過(guò)稱有關(guān)。陳貴清等[9]觀測(cè)同一余甘子植株果實(shí)成熟過(guò)程中內(nèi)含物變化，發(fā)現(xiàn)維生素C 和糖含量在翌年3月上旬達(dá)最大值，有機(jī)酸含量在翌年1月呈下降趨勢(shì)，單寧含量變化規(guī)律不明顯，纖維素含量在整個(gè)果實(shí)成熟期變化不大；趙虹等[10]對(duì)同一地點(diǎn)3 株余甘子植株不同成熟期果實(shí)主要成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)維生素C 和SOD 含量在每年11月初至翌年2月初含量最高，總糖含量在翌年2月后達(dá)最高。從以上研究結(jié)果來(lái)看，余甘子果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分的形成在較大程度上受到種質(zhì)區(qū)位和植株生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間的影響。區(qū)位和植株生長(zhǎng)發(fā)育的差異，很大程度上是對(duì)區(qū)域氣候差異的響應(yīng)，李昆等[11]進(jìn)行了不同省份余甘子果實(shí)形態(tài)和營(yíng)養(yǎng)成分分析，認(rèn)為氣溫有可能是影響余甘子果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分積累的主要因素。在生產(chǎn)實(shí)踐中，立秋后余甘子果實(shí)進(jìn)入成熟期，大量鮮果上市，而立冬后采收的果實(shí)更甘甜，味道更好。由于立秋至立冬期間普遍存在降溫乃至霜凍情況，溫度的變化，特別是低溫過(guò)程可能對(duì)余甘子果實(shí)風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生了影響，但目前鮮見(jiàn)立秋至立冬后降溫過(guò)程對(duì)余甘子果實(shí)主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量變化影響的相關(guān)研究報(bào)道。

云南永仁素有“太陽(yáng)城”之稱，光照充足，立秋后該區(qū)域余甘子果實(shí)普遍成熟，當(dāng)?shù)赜薪禍厮獌龊蟛墒沼喔首庸麑?shí)的習(xí)俗，是研究降溫后余甘子果實(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化和特色余甘子種質(zhì)風(fēng)味形成的較好的試驗(yàn)場(chǎng)所。本研究中以立秋、立冬2 個(gè)節(jié)氣為觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)，采集永仁同一地點(diǎn)同一居群的野生余甘子果實(shí)，對(duì)其蛋白質(zhì)含量、SOD 活性、氨基酸含量、維生素C 含量、總糖含量、總酸含量、總酚含量、硒含量進(jìn)行測(cè)定和比較，明確以霜凍為特征的降溫過(guò)程中余甘子果實(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累及變化特征，以期為余甘子果實(shí)風(fēng)味形成機(jī)制的研究提供數(shù)據(jù)，為余甘子果實(shí)的采收和加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

云南楚雄州永仁縣位于東經(jīng)101°14′—101°49′，北緯25°51′—26°30′，年均日照達(dá)2 824.4 h，年均氣溫17.8 ℃，年均降水量840 mm。取樣地點(diǎn)為永仁縣的野生余甘子林，選取同一居群生長(zhǎng)狀況基本一致的7 株代表性植株（YR01、YR02、YR03、YR05、YR06、YR07、YR08）作為研究樣本進(jìn)行采樣觀測(cè)。2018年，在果實(shí)成熟時(shí)進(jìn)行第1 次采果（立秋，8月），霜凍后進(jìn)行第2 次采果（立冬，10月）。2018年永仁地區(qū)全年氣溫變化情況如圖1 所示，8月后最高溫值及最低溫值均出現(xiàn)明顯下降，10月明顯出現(xiàn)霜降氣候，其中4月為余甘子果實(shí)初果期，5月至立秋前為果實(shí)膨大期，立秋后為果實(shí)成熟期。

圖1 2018年云南永仁縣各月平均氣溫的變化Fig.1 Mean monthly temperature changes of Yongren county of Yunnan in 2018

1.2 測(cè)定項(xiàng)目和測(cè)定方法

采用隨機(jī)抽樣的方法，按每株樹(shù)冠外層?xùn)|西南北4 個(gè)方向的上中下位置摘取果實(shí)。從所摘果實(shí)中隨機(jī)選取10 個(gè)果實(shí)，利用游標(biāo)卡尺測(cè)定果實(shí)橫縱徑、果肉厚，用電子天平（精度為0.001）測(cè)定單果質(zhì)量、果核質(zhì)量，取平均值。取果肉進(jìn)行室溫勻漿，各稱取0.1 g，待測(cè)。

采用微量法測(cè)定維生素C 的氧化速率，計(jì)算維生素C 含量；采用微量法測(cè)定蛋白質(zhì)含量；使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定570 nm 處吸光值，計(jì)算氨基酸含量；用超聲提取法進(jìn)行提取，使用分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，測(cè)定760 nm 處吸光值，計(jì)算總酚含量；用蒽酮比色法測(cè)定總糖含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Office Excel 2003 軟件整理數(shù)據(jù)，使用SAS 軟件進(jìn)行單因素方差分析及指標(biāo)間相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 霜凍前余甘子果實(shí)形態(tài)和功能成分

2.1.1 霜凍前果實(shí)形態(tài)和功能成分指標(biāo)

霜凍前（立秋）余甘子果實(shí)的形態(tài)及功能成分含量或活性見(jiàn)表1。由表1 可知，霜凍前余甘子YR05 樣株的果實(shí)橫徑顯著大于YR06、YR07樣株，與其他樣株差異不顯著（P＞0.05）；YR07 樣株果實(shí)縱徑顯著大于YR01、YR05 樣株，與其他樣株差異不顯著（P＞0.05）；YR05 樣株單果質(zhì)量顯著高于YR06、YR07 樣株，與其他樣株差異不顯著（P＞0.05）；YR06 樣株果肉厚顯著大于YR03、YR05、YR08 樣株（P＜ 0.05）；YR02 樣株果核質(zhì)量顯著大于YR05 樣株（P＜0.05）。

果實(shí)化學(xué)成分分析結(jié)果顯示，霜凍前余甘子果實(shí)蛋白質(zhì)含量平均值為294.85 mg/g，YR02 樣株果實(shí)蛋白質(zhì)含量最高，YR01 樣株含量最低，YR02 和YR05 樣株果實(shí)蛋白質(zhì)含量極顯著高于YR01、YR03、YR06、YR07、YR08 樣株（P＜0.01），變異系數(shù)為25.31。YR06 樣株果實(shí)的SOD 活性最高，為356.29 U/g，YR02 樣株最低，為242.08 U/g。果實(shí)SOD 活性平均值為297.38 U/g，高于均值的樣株有YR01、YR03、YR06、YR07，其中YR06樣株極顯著高于其他樣株（P＜0.01）。果實(shí)氨基酸含量平均值為28.06 μmol/g，含量最高為YR06樣株，最低為YR05 樣株，YR06 樣株果實(shí)氨基酸含量極顯著高于其他樣株（P＜0.01）。果實(shí)維生素C 含量平均值為1 084.8 nmol/g，最高為YR01樣株，其含量為1 739.12 nmol/g，最低為YR02樣株，其含量為817.42 nmol/g，YR01 樣株果實(shí)維生素C含量極顯著高于其他樣株（P＜0.01）。果實(shí)總糖含量平均值為48.13 mg/g，含量最高為YR02 樣株，含量最低為YR01 樣株，YR02 樣株果實(shí)總糖含量與YR05 樣株差異不顯著（P＞0.05），與其他樣株差異極顯著（P＜0.01）。果實(shí)總酸含量平均值為4.28%，最高為YR02 樣株，最低為YR05 樣株，YR02 樣株果實(shí)總酸含量極顯著高于其他樣株 （P＜0.01）。果實(shí)總酚含量平均值為22.88 mg/g，最高為YR02 樣株，最低為YR01 樣株，YR02 樣株果實(shí)總酚含量與YR05、YR08 樣株差異不顯著 （P＞0.05）。果實(shí)硒含量平均值為51.08 μg/kg，最高為YR03 樣株，最低為YR08 樣株，YR03 樣株果實(shí)硒含量極顯著高于其他樣株（P＜0.01）。所測(cè)指標(biāo)中變異系數(shù)最大的是硒含量，其次為單果質(zhì)量、氨基酸含量、維生素C 含量。

2.1.2 霜凍前果實(shí)形態(tài)和功能成分指標(biāo)間的相關(guān)性

霜凍前余甘子果實(shí)各指標(biāo)間的相關(guān)性見(jiàn)表2。由表2 可知，單果質(zhì)量與果肉厚、果實(shí)橫徑呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），與果實(shí)縱徑呈顯著相關(guān) （P＜0.05）；果肉厚與果實(shí)橫徑呈極顯著相關(guān)（P＜ 0.01）；果實(shí)蛋白質(zhì)含量與維生素C 含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與果實(shí)總糖含量、總酚含量極顯著相關(guān)（P＜0.01）；果實(shí)維生素C 含量與總酚含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；單果質(zhì)量、果實(shí)橫徑與果實(shí)SOD 活性呈顯著相關(guān)；果肉厚與果實(shí)硒含量呈顯著相關(guān)（P＜0.05）。

表1 霜凍前余甘子果實(shí)的形態(tài)及功能成分含量或活性?Table 1 Morphology and contents or activity of functional components in P.emblica fruits before frost

表2 霜凍前余甘子果實(shí)各指標(biāo)間相關(guān)性?Table 2 Correlation between indexes in P.emblica fruits before frost

2.2 霜凍后余甘子果實(shí)形態(tài)和功能成分

2.2.1 霜凍后果實(shí)形態(tài)和功能成分指標(biāo)

霜凍后（立冬）余甘子果實(shí)的形態(tài)及功能成分含量或活性見(jiàn)表3。由表3 可知，YR05 樣株的果實(shí)橫徑顯著大于YR01、YR02、YR06、YR07、YR08 樣 株（P＜0.05），YR08樣株的果實(shí)縱徑顯著大于其他樣株（P＜0.05）；YR08樣株單果質(zhì)量顯著高于YR01、YR02、YR03、YR07 樣株（P＜0.05）；YR05 樣株果肉厚顯著大 于YR01、YR02、YR05、YR07、YR08 樣株（P＜0.05）；YR06 樣株果核質(zhì)量顯著大于其他樣株（P＜0.05）。

表3 霜凍后余甘子果實(shí)的形態(tài)及功能成分含量或活性Table 3 Morphology and contents or activity of functional components in P.emblica fruits after frost

果實(shí)化學(xué)成分分析結(jié)果顯示，余甘子果實(shí)蛋白質(zhì)含量平均值為329.93 mg/g，高于均值的樣株有YR02、YR05、YR06、YR07，其中YR05 樣株果實(shí)蛋白質(zhì)含量極顯著高于其他樣株（P＜0.01）。YR01 樣株果實(shí)SOD 活性最高，為316.86 U/g， YR02樣株最低， 為237.54 U/g， 平均值為 269.23 U/g，高于均值的樣株有YR01、YR07、YR08，其中YR01 樣株果實(shí)SOD 活性極顯著高于YR02、YR03、YR05、YR06、YR07 樣株（P＜0.01）。果實(shí)氨基酸含量平均值為36.97 μmol/g，含量最高為YR06 樣株，最低為YR08 樣株，YR06 樣株果實(shí)氨基酸含量極顯著高于其他樣株（P＜0.01）。果實(shí)維生素C 含量平均值為1 074.53 nmol/g，YR06 樣株最高，含量為1 059.89 nmol/g，YR02樣株含量最低，為643.43 nmol/g，YR01 樣株果實(shí)氨基酸含量極顯著高于其他樣株（P＜0.01）。果實(shí)總糖含量平均值為52.97 mg/g，含量最高為YR02 樣株，含量最低為YR08 樣株。果實(shí)總酸含量平均值為3.71%，最高為YR08 樣株，最低為YR02 樣株。果實(shí)平均總酚含量為23.00 mg/g，最高為YR02 樣株，最低為YR03 樣株。果實(shí)硒含量平均值為19.26 μg/kg，最高為YR03 樣株，最低為YR06 樣株，YR03 樣株果實(shí)硒含量極顯著高于其他樣株（P＜0.01）。所測(cè)指標(biāo)中，變異系數(shù)最大的為氨基酸含量，其次為硒含量。

2.2.2 霜凍后果實(shí)形態(tài)和功能成分指標(biāo)間的相關(guān)性

霜凍后余甘子果實(shí)各指標(biāo)間的相關(guān)性見(jiàn)表4。由表4 可知，果肉厚與果實(shí)橫徑呈極顯著相關(guān) （P＜0.01）；單果質(zhì)量與果實(shí)橫徑呈顯著相關(guān)（P＜ 0.05）；果核質(zhì)量與果實(shí)縱徑呈顯著相關(guān)（P＜ 0.05）；果實(shí)維生素C 含量與總糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與總酸含量顯著相關(guān)（P＜ 0.05）；果實(shí)總糖含量與總酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；果實(shí)縱徑與總酸含量呈顯著相關(guān) （P＜0.05）。

2.3 霜凍前后余甘子果實(shí)功能成分的變化

通過(guò)比較表1 和表3 中數(shù)據(jù)可知，霜凍前后余甘子果實(shí)的功能成分的含量或活性發(fā)生了顯著變化。霜凍后，果實(shí)蛋白質(zhì)、氨基酸、總糖、總酚含量均增加。其中，氨基酸含量由28.06 μmol/g增大到36.97 μmol/g；總糖含量由48.13 mg/g 增加到52.97 mg/g；蛋白質(zhì)含量由294.85 mg/g 增大到329.93 mg/g，增幅最大；總酚含量均值變化最小，由霜凍前的22.88 mg/g 變?yōu)?3.00 mg/g。另一方面，霜凍后余甘子果實(shí)SOD 活性由297.38 U/g 降低到269.23 U/g；維生素C 含量由1 084.80 nmol/g 降低到887.82 nmol/g；總酸含量由4.28%降低到3.71%；硒元素含量由51.08 μg/kg 降低到19.26 μg/kg。結(jié)果表明，霜凍有改變余甘子果實(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)形成或積累的作用。

表4 霜凍后余甘子果實(shí)各指標(biāo)間的相關(guān)性Table 4 Correlation between indexes in P.emblica fruits after frost

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，霜凍有改變余甘子果實(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)形成或積累的作用。霜凍前，果實(shí)SOD活性、維生素C 含量、硒含量較高，可根據(jù)生產(chǎn)利用決定其采收期。單果質(zhì)量、果實(shí)橫徑與果實(shí)SOD 活性呈顯著相關(guān)，果肉厚與硒含量呈顯著相關(guān)，在野外采果的時(shí)候可作為參考依據(jù)。霜凍后，果實(shí)蛋白質(zhì)、氨基酸、總糖含量較高，這個(gè)階段的果實(shí)口感較好。果實(shí)維生素C 含量與總糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與總酸含量顯著相關(guān)；總糖含量與總酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；果實(shí)的縱徑與總酸含量呈顯著相關(guān)。因此，瓜形果實(shí)的總酸含量較低，口感較好，這對(duì)野外資源收集有一定的參考作用。

氣候?qū)χ参锕麑?shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的形成和積累具有重要作用，其中溫度是重要的指標(biāo)之一。如年極端最高氣溫升高會(huì)降低油茶鮮果的含油量[12]。本研究結(jié)果表明，余甘子果實(shí)的橫徑、縱徑、單果質(zhì)量、果肉厚、果核質(zhì)量等指標(biāo)在霜凍前后存在顯著差異，這一結(jié)果表明霜凍后余甘子果實(shí)生長(zhǎng)模式發(fā)生了變化。同時(shí)，同一居群余甘子果實(shí)形態(tài)有不同程度的差異，這一結(jié)論與瞿文林等[13]認(rèn)為余甘子果實(shí)表型性狀在居群內(nèi)存在著豐富的變異相吻合。霜凍后，余甘子果實(shí)的蛋白質(zhì)、氨基酸、總糖和總酚含量增加，維生素C、硒和總酸含量減少，SOD 活性極顯著降低，表明低溫會(huì)導(dǎo)致余甘子果實(shí)化合物積累模式發(fā)生改變。郭蘭萍等[14]認(rèn)為植物化學(xué)表型形成的機(jī)制是遺傳變異與環(huán)境飾變的共同作用?？刂浦参锘瘜W(xué)表型的功能基因存在于核基因中，核基因在居群間通過(guò)種子流和花粉流傳遞。余甘子為雌雄同株異花，種子傳播范圍有限，群體間地理間隔較大，不同居群間進(jìn)行基因流的機(jī)會(huì)少[15]，而同一居群內(nèi)基因交流多，這可能是導(dǎo)致本研究中余甘子果實(shí)化學(xué)類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量差異的又一重要原因。一般認(rèn)為，SOD 活性降低表明果實(shí)體內(nèi)清除自由基的能力減弱，此時(shí)果實(shí)體內(nèi)代謝平衡受阻，膜系統(tǒng)功能及結(jié)構(gòu)受到破壞[16-17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，霜凍后余甘子果實(shí)SOD 活性極顯著降低，說(shuō)明霜凍過(guò)程對(duì)余甘子果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育具有破壞性作用，但這種破壞作用對(duì)余甘子風(fēng)味形成的作用尚不明了。此外，鐘振國(guó)等[18]對(duì)我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)余甘子果實(shí)的沒(méi)食子酸含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)云南產(chǎn)區(qū)余甘子果實(shí)的沒(méi)食子酸含量均高于其他地區(qū)。由于云南山地立體氣候明顯，相對(duì)多變的環(huán)境條件可能與這些次生代謝物的形成和積累關(guān)系密切。在后續(xù)的研究中，生物氣候指標(biāo)與余甘子沒(méi)食子酸等特殊化合物的形成及積累間關(guān)系的研究應(yīng)得到重視。

霜凍前余甘子果實(shí)蛋白質(zhì)含量與維生素C、總糖、總酚含量極顯著相關(guān)，霜凍后余甘子果實(shí)維生素C 含量與總糖含量極顯著相關(guān)，總糖含量與總酸含量極顯著負(fù)相關(guān)，這可能與低溫對(duì)植物光合作用過(guò)程的影響有關(guān)。蘇文華等[19]認(rèn)為光合作用過(guò)多積累的碳，用于合成酚類等以碳為基礎(chǔ)的次生代謝物質(zhì)就會(huì)增多，含氮的次生代謝產(chǎn)物減少。低溫對(duì)氮代謝有深刻影響，低溫脅迫下，由于降解速率下降或合成加強(qiáng)，植物可溶性蛋白含量增加[16]。在正常情況下，植物體內(nèi)游離氨基酸含量較低[20]，而在低溫脅迫條件下，游離氨基酸含量迅速上升[21]，這可能是造成本研究中霜凍后余甘子果實(shí)氨基酸含量顯著升高的原因。此外，霜凍后余甘子果實(shí)總糖含量顯著高于霜凍前，而總酸含量顯著低于霜凍前，且霜凍后余甘子果實(shí)總糖含量與總酸含量有極顯著的相關(guān)性，表明霜凍可能會(huì)促進(jìn)果實(shí)總酸向總糖的轉(zhuǎn)變。硒對(duì)植物的生理功能有重要作用，參與蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)代謝，增強(qiáng)植物體內(nèi)的抗氧化能力[22]， 植物根系活力隨著硒濃度的上升而增加，植物根系活力和葉綠素含量與硒濃度有關(guān)[23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，余甘子果實(shí)硒含量與SOD 活性、維生素C 含量、總酚含量等主要余甘子果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)無(wú)相關(guān)性，而霜凍后余甘子果實(shí)硒含量減少，SOD 活性、維生素C 含量、總酸含量均減少，這些指標(biāo)的變化是否與霜凍后余甘子葉片掉落，光合作用減少，根活力降低有關(guān)，其具體原因有待進(jìn)一步研究。