梅子寒 楊杰 王煒 曹鵬 楊艷 李鵬飛 朱可夫 江滔 張夢(mèng)婷

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是一種嚴(yán)重的致盲性糖尿病眼部并發(fā)癥。對(duì)中國(guó)1990～2017年45歲以上的糖尿病患者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，DR 發(fā)病率為17.22%[1]。幾乎所有病程在 10 年以上的糖尿病患者都存在不同程度的視網(wǎng)膜病變[2]。DR導(dǎo)致的失明占所有失明人數(shù)的8.9%[3]?？梢?，DR的患病率高，致盲率高，嚴(yán)重影響國(guó)民生存質(zhì)量，因此早期診斷、積極治療DR是防治糖尿病并發(fā)癥病變的一項(xiàng)重要內(nèi)容。脈絡(luò)寧注射液由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(江蘇省中醫(yī)藥研究院)研制，由玄參、石斛、牛膝、金銀花、黨參等藥物提取后制成的中藥復(fù)方制劑，具有清熱化陰、活血化瘀的功效[4]。大量臨床研究證實(shí)該藥在糖尿病視網(wǎng)膜病治療方面療效顯著[5-8]。該藥能抑制體外高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，對(duì)高糖環(huán)境下的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用[9]。DR的發(fā)生發(fā)展是由多種細(xì)胞因子參與、炎癥、離子通道和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝酶共同調(diào)控的復(fù)雜過程。PI3K/Akt通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，分化過程中起著重要的作用，Akt 在視網(wǎng)膜組織中是一個(gè)內(nèi)源性的視網(wǎng)膜生存因子。在高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變模型中，高糖環(huán)境直接或間接的抑制了內(nèi)源性 Akt 的生成及表達(dá)，造成視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡增加，增殖減少。在糖尿病發(fā)生和發(fā)展過程中，持續(xù)的高血糖能夠促進(jìn)PI3K/Akt通路活化，從而促使多種細(xì)胞因子合成與釋放，最終加速DR的發(fā)展過程。本研究基于PI3K/Akt信號(hào)通路在維持正常視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞存活中所起的關(guān)鍵作用[10]，我們擬從該信號(hào)通路研究脈絡(luò)寧注射液防止早期糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用機(jī)制，將進(jìn)一步明確脈絡(luò)寧注射液在DR早期的治療作用及分子機(jī)制，并進(jìn)一步為揭示DR早期病變的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

SPF級(jí)SD雄性大鼠30只，體重200～220 g，由青島市藥檢所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有大鼠均飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物中心，單籠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，室溫18～22 ℃。人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞HRCEC(購(gòu)自北京協(xié)和庫(kù))。

2 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備

鏈脲佐菌素(Sigma公司產(chǎn)品)；血糖儀、血糖試紙(美國(guó)強(qiáng)生Lifescan公司)；脈絡(luò)寧注射液(金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠)；葡萄糖(Sigma公司產(chǎn)品)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品)；Akt、p-Akt、PI3K、Bcl2、caspase抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)、二抗(美國(guó)Cell Signalling公司)；熒光定量PCR儀7500型(南京鈦格威生物技術(shù)有限公司)；Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)(美國(guó)LICOR公司)；微量移液器(艾本德公司)。

3 DR模型的建立、分組及給藥

將30只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、脈絡(luò)寧組，每組10只。待各組大鼠體重在200～250 g時(shí)采用鏈脲佐菌素 (Streptozotocin,STZ)誘發(fā)糖尿病造模。造模前，將各組大鼠禁食12 h。用0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液配成10 g/L的STZ，實(shí)驗(yàn)組大鼠按60 mg/kg劑量左下腹腔內(nèi)注射STZ，對(duì)照組大鼠注射等量的溶劑(0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液)72 h后取尾血測(cè)血糖及尿糖。凡血糖≥16.7 mmol/L及尿糖陽(yáng)性的大鼠定為糖尿病模型。自造模成功后開始進(jìn)行脈絡(luò)寧注射液腹腔注射，每日一次，劑量為0.92 mL/kg(按照人臨床給藥量為10 mL,一日一次，大鼠換算系數(shù)為5.5進(jìn)行劑量換算),連續(xù)給藥12 w?？瞻讓?duì)照組和模型組腹腔注射等體積的生理鹽水。

4 檢測(cè)磷酸化Akt蛋白在大鼠視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)

給藥結(jié)束時(shí)處死各組大鼠取出左側(cè)眼球，沿著角膜緣剪開眼球的角膜，去除角膜、晶狀體和玻璃體后，用眼科刀將視網(wǎng)膜取出。Western blot檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜組織中p-Akt、Akt蛋白以及PI3K、Bcl2、Caspase 3水平。利用RIPA裂解液裂解4C°離心收集上清測(cè)定蛋白濃度，使用 2×還原上樣緩沖液調(diào)節(jié)各組蛋白濃度一致，100℃水浴保溫 5min，SDS-PAGE 電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，1% BSA 封閉2 h，一抗4C°振蕩孵育過夜，TBST振蕩清洗三次，每次5 min。二抗室溫?fù)u床振蕩孵育1 h，TBST振蕩清洗三次，每次5 min。HRP標(biāo)記二抗用ECL顯色曝光，對(duì)照Marker記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

5.1體外培養(yǎng)HRCEC(人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞)

HRCEC細(xì)胞在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為 2×105/mL，每孔2 mL接種于6孔培養(yǎng)板中。將細(xì)胞分為三組：正常對(duì)照組、高糖組、脈絡(luò)寧組。除正常對(duì)照組外，其余各組均采用25 mmol/L葡萄糖進(jìn)行高糖培養(yǎng)來模擬體內(nèi)高糖環(huán)境，同時(shí)脈絡(luò)寧組加入0.8 μg/mL脈絡(luò)寧注射液，處理時(shí)間均為72 h。

5.2Westen blot檢測(cè)HRCEC細(xì)胞中Akt、p-Akt、PI3K、Bcl2、Caspase的蛋白水平

收集各組細(xì)胞，用PIPA裂解，4C°離心收集上清測(cè)定蛋白濃度，使用2×還原上樣緩沖液調(diào)節(jié)各組蛋白濃度一致，100C°水浴保溫5min，SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，1% BSA封閉2 h，一抗4 ℃振蕩孵育過夜，TBST振蕩清洗三次，每次5 min。二抗室溫?fù)u床振蕩孵育1 h，TBST振蕩清洗三次，每次5 min。HRP標(biāo)記二抗用ECL顯色曝光，對(duì)照Marker記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5.3檢測(cè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)組大鼠視網(wǎng)膜中的中Akt、PI3K、Bcl2和Caspase 3 mRNA水平

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

7 結(jié)果

7.1絡(luò)寧注射液抑制HRCEC 細(xì)胞中p-Akt蛋白的表達(dá)

與正常對(duì)照組比較，高糖誘導(dǎo)組細(xì)胞中p-Akt蛋白水平明顯增加；脈絡(luò)寧給藥組p-Akt蛋白表達(dá)量明顯低于高糖誘導(dǎo)組(圖一)。可見，脈絡(luò)寧可以抑制高糖誘導(dǎo)的HRCEC 細(xì)胞中高水平的p-Akt的表達(dá)。

7.2脈絡(luò)寧注射液可降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中p-Akt及其上游激酶PI3K以及下游促凋亡蛋白Bcl2、Caspase蛋白水平

與正常對(duì)照組大鼠比較，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中 p-Akt水平明顯增加，脈絡(luò)寧注射液給藥能抑制糖尿病大鼠中高水平的p-Akt，而AKT總蛋白在正常對(duì)照組、糖尿病組、脈絡(luò)寧給藥組之間無(wú)明顯變化。促進(jìn)Akt發(fā)生磷酸化的上游激酶PI3K以及Akt下游的促凋亡蛋白Bcl2、Caspase的蛋白水平在各組間顯示出與p-Akt相同的變化趨勢(shì)，由此可見，脈絡(luò)寧注射液能抑制糖尿病大鼠中高水平的pAkt、PI3K、Bcl2和Caspase的蛋白表達(dá)(圖1)。

圖1 脈絡(luò)寧給藥對(duì)高糖誘導(dǎo)的pAkt表達(dá)的影響

7.3脈絡(luò)寧注射液可降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中PI3K以及促凋亡的基因Bcl2、Caspase 3的表達(dá)

通過Real-time PCR的方法對(duì)Akt上下游相關(guān)的基因的檢測(cè)結(jié)果表明 AKT 的mRNA水平在正常對(duì)照組、糖尿病組、脈絡(luò)寧給藥組三組間的表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1);與正常對(duì)照組比較，PI3K的mRNA水平在糖尿病組和脈絡(luò)寧給藥組中均顯著升高(P<0.01)；與糖尿病組比較，脈絡(luò)寧顯著下調(diào)了PI3K的mRNA水平(P<0.05); Bcl2、Caspase mRNA在糖尿病組和模型組中均表達(dá)增加，脈絡(luò)寧干預(yù)后其表達(dá)水平均顯著降低。脈絡(luò)寧注射液顯著抑制了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中PI3K、Bcl2和Caspase的mRNA的表達(dá)。

圖2 脈絡(luò)寧給藥對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中中各Akt相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Fig.2 The effect of mailuoning on the expression of Akt related proteins in diabetic rat retinal tissue

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Akt、PI3K、Bcl2、caspase mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：采用單因素方差分析，與空白對(duì)照組比較，##：P<0.01，###:P<0.005;與模型組比較,*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.005

8 討論

DR是糖尿病微血管病變?cè)谘鄣转?dú)特環(huán)境中的表現(xiàn)，長(zhǎng)期慢性的高血糖癥是其發(fā)病的基礎(chǔ)。DR發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是高血糖癥及其引起的組織缺血缺氧導(dǎo)致的一系列病理改變，包括視網(wǎng)膜微血管的滲漏、閉鎖，進(jìn)而造成視網(wǎng)膜組織水腫(尤其是黃斑水腫)、滲出、出血以及組織缺血缺氧引起的新生血管的形成，可進(jìn)一步發(fā)展為玻璃體出血和牽拉性視網(wǎng)膜脫離，最終導(dǎo)致盲目[11]。DR的早期變化為視網(wǎng)膜的損傷，毛細(xì)血管基底膜增厚，周細(xì)胞和視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(retinal microvascular endothelial cells，RMECs)喪失，其喪失的性質(zhì)為細(xì)胞凋亡[12]。視網(wǎng)膜缺血使促血管生成物質(zhì)增加，引起視網(wǎng)膜新生血管形成，從而導(dǎo)致增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生。周細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞起支持作用，且具有收縮功能，可調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管局部的血流量和血管通透性，對(duì)于微血管結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定起著重要的作用；內(nèi)皮細(xì)胞之間以緊密連接的方式相互連接，構(gòu)成的血視網(wǎng)膜屏障 (blood retinal barrier，BRB)是其中最為重要的內(nèi)屏障[13]。因此內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性對(duì)維持視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的穩(wěn)定性具有十分重要的作用，成為早期糖尿病視網(wǎng)膜病變治療的關(guān)鍵。

PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由Akt、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)、促凋亡因子Bad(bcl-2-associated death protein,Bad)等一系列相關(guān)因子組成，通過促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡等生命活動(dòng)，來參與糖尿病、腫瘤等多種疾病的病理過程，是體內(nèi)細(xì)胞存活的一條重要的通路[14-16]。大量研究表明Akt信號(hào)通路的激活能夠抑制各種各樣細(xì)胞凋亡刺激所誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡，且顯負(fù)性Akt干擾正常AKT信號(hào)能夠促進(jìn)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞生存[17-20]。在高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變模型中，高糖環(huán)境直接或間接的抑制了內(nèi)源性Akt的生成及表達(dá)，促進(jìn)磷酸化Akt的產(chǎn)生，造成視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡增加，增殖及遷移減少，大量的血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡造成血管閉塞，形成視網(wǎng)膜無(wú)灌注區(qū)。本實(shí)驗(yàn)中，體外HRCEC細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)脈絡(luò)寧能抑制高糖誘導(dǎo)的HRCEC細(xì)胞中的pAkt水平的增加。體內(nèi)糖尿病模型小鼠上研究發(fā)現(xiàn)，脈絡(luò)寧能抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的高表達(dá)的pAkt并且也能抑制糖尿病大鼠中Akt的上游激酶PI3K以及下游促凋亡蛋白Bcl-2、Csapase3的基因mRNA的表達(dá)以及蛋白水平的增加。

綜上所述，我們通過大鼠糖尿病模型上的體內(nèi)藥效試驗(yàn)和在人視網(wǎng)膜細(xì)胞HRCEC上的高糖誘導(dǎo)的損傷模型上的研究揭示了脈絡(luò)寧注射液通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路來介導(dǎo)對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜細(xì)胞的保護(hù)作用從而改善早期糖尿病視網(wǎng)膜脈絡(luò)病變的作用。