賀付蒙,李秀鈺,趙瀟璨,武佳文,朱元芳,周 磊,石奇海,劉 娣,李鳳蘭

(1.東北農業(yè)大學 生命科學學院,黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省農業(yè)科學院,黑龍江 哈爾濱 150086)

馬鈴薯(Solanumtuberosum)茄科茄屬,因其塊莖淀粉含量高且營養(yǎng)全面,既可作為蔬菜也可用于餐桌主食,是重要的糧食作物[1]。馬鈴薯作為世界范圍內主要的糧食作物之一,其地位僅次于小麥、玉米和水稻,而中國作為最大的馬鈴薯生產國之一,現(xiàn)正成為世界馬鈴薯產量的領跑者[2]。馬鈴薯在田間種植和窖儲過程中常受細菌性病害及真菌性病害的威脅,主要的病害有枯萎病、早疫病、晚疫病、粉痂病、干腐病、青枯病、軟腐病等,嚴重制約著我國馬鈴薯產業(yè)的發(fā)展[3]。

病程相關蛋白(Pathogenesis related protein,PR蛋白)是植物體內快速檢測致病因子及非生物脅迫并產生防御機制的一類蛋白,其通過誘導因子的誘導直接參與到植物的抗病過程中[4]。PR 蛋白廣泛分布于植物各個結構中[5],植物的葉片是該類基因的主要存在處及發(fā)揮作用的場所[6]。植物識別病原體和害蟲衍生的信號,感知它們并利用這些線索誘導防御行為的產生,使得植物對害蟲和病原體攻擊時由 PR 蛋白的積累進行防御,它們通常是約 6～43 ku 的低分子量蛋白質,熱穩(wěn)定,耐蛋白酶,在低 pH 下仍可溶解[7]。Chun等[8]發(fā)現(xiàn)聚糖納米粒子(CNPs)具有控制由鐮孢菌引起一系列病害的能力,使用 CNPs 脅迫植物時,PR1和PR10基因顯著上調,并且證實CNPs 通過誘導 PR 蛋白的產生來達到生物防治的目的。為評估殼聚糖在處理期間對植物的誘導作用,選擇在 SAR代謝途徑中至關重要的2個基因PR1及PR5,發(fā)現(xiàn)殼聚糖作為誘導物誘導植物體時,使得PR1和PR5表達量明顯上調,進而 SAR開始防御工作,證明PR1和PR5在植物體內的防御反應中發(fā)揮重要作用[9]。Wang 等[10]從百合屬中分離出2個Ⅱ類PR4家族基因,其在病原體感染期間積累,參與植物抗病性,在百合抗病中起重要作用。李秀鈺等[11]克隆了馬鈴薯PR1基因,進行了生物信息學分析,預測分析了該基因在抗病中的作用。為了進一步了解馬鈴薯PR1基因在抗病中的功能,本試驗成功構建了植物表達載體pBI121-StPR1,并利用農桿菌轉化法將StPR1基因導入煙草中,獲得轉基因煙草,并且對轉基因煙草進行抗病性及生理特性分析,為PR1基因在植物的抗病方面提供了理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 馬鈴薯(大西洋品種)由黑龍江省農業(yè)科學院提供。煙草(山西品種)由東北農業(yè)大學植物資源與分子生物學研究室保存并提供。

1.1.2 菌株和載體 植物表達載體pBI121、大腸桿菌 DH5α和農桿菌GV3101由東北農業(yè)大學植物資源與分子生物學研究室保存提供。

細菌病害軟腐病病菌胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia.carotovorasubsp.CarotovoraBorgey,Ecc)、菊歐氏菌(E.chrysanthemiBurkholder.AtrosepticaDye,Ech)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌馬鈴薯黑脛亞種(E.carotovorasubsp.McFaddenetDimock,Eca)和青枯病病菌茄科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum,RS)、真菌病害干腐病病菌接骨木鐮孢(Fusariumsambucinum)、燕麥鐮孢(F.avenaceum)由東北農業(yè)大學植物資源與分子生物學研究室保存提供。

1.1.3 試劑與酶 RNA提取試劑盒購自BioTeke ；反轉錄試劑盒、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、高保真Taq酶、T4連接酶購自北京全式金生物公司；限制性內切酶XbaⅠ和BamH Ⅰ購自NEB公司；普通Taq酶、LB營養(yǎng)瓊脂、LB肉湯、MS培養(yǎng)基等試劑購自哈爾濱美恒試劑公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 根據NCBI上公布的馬鈴薯病程相關蛋白PR1(XM-006367029.2),找到CDS區(qū),使用Primer Premier 5.0進行PR1克隆引物的設計,上游引物為PR1-F(5′-GCTCTAGAATGGGATACTCC AATATTGCCTTAA-3′)，下游引物PR1-R(5′-CGCGG ATCCTTAGATATCAGTTGGAAGTTCCA-3′), 并在上下游引物的 5′ 端分別引入了XbaⅠ和BamHⅠ酶切位點。引物由庫美生物公司合成。

1.2.2 RNA提取及cDNA的合成 RNA的提取參照BioTeke試劑盒進行,檢測其OD260/280為1.8～2.1可用。參照全式金試劑盒進行cDNA的合成,用β-actin對cDNA質量進行檢測(β-actin-F：5′-GCTTCC CGATGGTCAAGTCA-3′；β-actin-R：5′-GGATTCCAG CTGCTTCCATTC-3′)。

1.2.3 植物表達載體的構建 用引物PR1-F、PR1-R對基因StPR1進行擴增,體系為50 μL。回收PCR產物。T4連接酶連接用XbaⅠ和BamHⅠ分別雙酶切回收后的 PCR 產物和pBI121空載體并轉化 DH5α,PCR和酶切鑒定陽性克隆,測序檢測有無移碼、突變。測序由庫美生物公司完成。凍融法轉化農桿菌GV3101并進行鑒定。

1.2.4 轉基因煙草植株的獲得 煙草種子消毒參照胡重怡等[12]方法,無菌條件下將種子種植到 1/2MS 培養(yǎng)基上,置于 25 ℃,16 h 光照無菌室中。待煙草長出 5 片左右真葉時,進行煙草葉盤法侵染[13],侵染后放到愈傷培養(yǎng)基中,14 d后將葉盤轉入到分化培養(yǎng)基中,7 d左右葉盤周圍會長出抗性芽,待其長到 2～3 cm時將抗性芽切離葉盤,置于生根培養(yǎng)基中。待轉基因幼苗生根,長至 8～10 cm 左右,將三角瓶上的封口膜打開,進行壯苗。壯苗 3～5 d后,將其轉置到土中進行培養(yǎng)(土∶蛭石=3∶1)。使用葉盤法獲得野生型煙草植株與轉基因型進行對照。

1.2.5 轉基因煙草的檢測 利用北京全式金生物技術有限公司 DNA 提取試劑盒提取轉基因煙草的總DNA,利用PCR檢測轉基因煙草植株。

1.2.6 轉基因煙草抗病性分析 選擇長勢良好,葉片翠綠的野生型及轉基因煙草,使用剪刀將葉片剪下,用無菌水浸泡過的脫脂棉將葉柄部包緊,將干凈的培養(yǎng)皿底部放上滅菌的濾紙,使用 3 000 μL 無菌水浸濕濾紙。馬鈴薯真菌病原菌接種方法是將培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基 PDA 中的接骨木鐮孢及燕麥鐮孢用打孔器取直徑為 1 cm 的菌塊置于葉片上。馬鈴薯細菌病原菌接種方法是吸取 300 μL Ecc、Eca、Ech 及 RS 細菌菌液(OD600值在 1.0～1.5)置于葉片上,以 300 μL 無菌水置于葉片上為對照,每種處理 3 個生物學重復。處理完成后用保鮮膜將培養(yǎng)皿封住,在保鮮膜上用大頭針扎些小洞。分別在處理 3,6,9,12,15 d 進行葉面病斑直徑(單位：cm)測量并記錄。

1.2.7 轉基因煙草的生理指標測定 材料處理及病原菌接種方法同 1.2.6,分別在處理 0,4,12,36,48 h 時,取 3 g 樣本,液氮速凍,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、過氧化物酶(Peroxidase,POD)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性采用試劑盒測定。具體操作方法參考哈爾濱市凱譽生物科技有限公司 SOD、POD、CAT 試劑盒。

1.2.8 數據處理 數據統(tǒng)計使用 Microsoft Excel 2007；統(tǒng)計分析使用 SPSS 15.0；統(tǒng)計圖制作使用 GraphPad Prism 5。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯塊莖中 RNA 的提取

馬鈴薯總 RNA 的提取結果獲得 28S 及 18S條帶(圖1),無彌散出現(xiàn),其完整性以及穩(wěn)定性均達到后續(xù)試驗要求。進行cDNA的合成。

2.2 含酶切位點的基因擴增

使用含有酶切位點的特異性引物進行 PCR擴增,PCR擴增PR1基因的CDS序列,擴增產物在 540 bp 出現(xiàn)特異性條帶(圖 2),大小與預期相符,回收目的條帶。

M.DNA 分子量標準 2000；1-3.樣品RNA。M.DL2000 DNA Marker；1-3.Sample RNA.

M.DNA 分子量標準 2000；1-2.PCR 產物。M.DL2000 DNA Marker；1-2.The PCR production.

2.3 表達載體鑒定

對菌液進行陽性篩選,菌液PCR結果獲得了目的性片段,其長度在540 bp(圖 3),大小與基因相同。

M.DNA 分子量標準 2000；1-5.PCR 產物。M.DL2000 DNA Marker；1-5.The PCR production.

使用XbaⅠ和BamHⅠ對重組質粒進行雙酶切,結果在 540 bp 處獲得目的片段(圖4),確定表達載體構建成功,命名為進行pBI121-StPR1。

2.4 農桿菌轉化鑒定

將重組質粒轉化至GV3101中,在 Kan 和 Rif 培養(yǎng)基上進行篩選,陽性菌落擴繁,擴繁后對該菌液進行 PCR 鑒定,菌液PCR結果獲得了目的性片段,其長度在540 bp(圖5),確定農桿菌轉化成功。

M1.DNA 分子量標準 15000；1.pBI121 原質粒；2.pBI121-StPR1 質粒；3.pBI121-StPR1 質粒雙酶切；M2.DNA 分子量標準 2000。M1.DL15000 DNA Marker；1.pBI121 original plasmid；2.pBI121-StPR1 plasmid； 3.pBI121-StPR1 plasmid double digestion；M2.DL2000 DNA Marker.

2.5 轉基因煙草的檢測

對轉基因煙草進行抗性篩選,在7 d產生明顯的差別,野生型煙草葉盤發(fā)黃,葉盤邊緣褶皺處于死亡狀態(tài),無分化芽產生。轉化后煙草葉盤逐漸變大生長,長出明顯的愈傷部分,并且有分化芽出現(xiàn)(圖6)。將轉基因型煙草分化芽放入抗性生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)(圖7)。

M.DNA 分子量標準 2000；1-6.重組質粒轉化農桿菌后 PCR 鑒定。M.DL2000 DNA Marker；1-6.PCR identification after transformation of recombinant plasmid into Agrobacterium.

圖6 轉基因抗性植株的篩選Fig.6 Screening of transgenic resistant plants

圖7 煙草葉盤上芽的生根培養(yǎng)Fig.7 Rooting of buds on tobacco leaf discs

隨機取遺傳轉化植株葉片,進行 DNA 的提取(圖8),并對野生型煙草及轉基因煙草進行了 PCR 檢測(圖9),野生型無擴增條帶,轉基因植株出現(xiàn)擴增條帶,證明StPR1成功轉入煙草中。

M.DNA 分子量標準 15000；1.野生型煙草 DNA；2-3.轉 StPR1 基因煙草 DNA。M.DL15000 DNA Marker；1.Wild type tobacco DNA；2-3.Transgenic StPR1 gene tobacco DNA.

M.DNA 分子量標準 2000；1.重組質粒為模板的 PCR 產物；2.野生型煙草 DNA為模板；3.轉StPR1基因煙草 DNA 為模板。

M.DL2000 DNA Marker；1.PCR product of recombinant plasmid as template；2.Wild type tobacco DNA as a template；3.Transfer ofStPR1gene tobacco DNA as a template.

圖9 轉基因植株的 PCR 鑒定
Fig.9 PCR identification of transgenic plants

Ecc-WT.Ecc 脅迫野生型煙草；Ecc-P35S:StPR1.Ecc 脅迫轉基因型煙草；Eca-WT.Eca脅迫野生型煙草；Eca-P35S:StPR1.Eca 脅迫轉基因型煙草；Ech-WT.Ech 脅迫野生型煙草； Ech-P35S:StPR1.Ech 脅迫轉基因型煙草；RS-WT.RS 脅迫野生型煙草；RS-P35S:StPR1.RS 脅迫轉基因型煙草。不同小寫字母表示同一處理時間處理間差異顯著(P<0.05)。圖11-17同。

Ecc-WT.Ecc stress wild type tobacco；Ecc-P35S:StPR1.Ecc stress transgenic tobacco； Eca-WT.Eca stress wild type tobacco；Eca-P35S:StPR1.Eca stress transgenic tobacco；Ech-WT. Ech stress wild type tobacco；Ech-P35S:StPR1.Ech stress transgenic tobacco；RS-WT.RS stress wild type tobacco；RS-P35S:StPR1.RS stress transgenic tobacco.Different small letters indicate significant difference among treatments under the same processing time(P<0.05). The same as Fig.11-17.

圖10 馬鈴薯主要致病細菌脅迫下野生型煙草和轉基因煙草病斑直徑比較
Fig.10 Comparison of lesion diameters of wild type tobacco and transgenic tobacco under the stress of potato mainly pathogenic bacteria

2.6 轉基因煙草抗病性分析

將軟腐病致病菌 Ecc、Eca、Ech 和青枯病致病菌 RS 接種轉StPR1基因煙草及野生型煙草葉片,對病斑直徑的變化進行觀察測量(圖10)。由結果可以看出,接種病原菌后,葉片上的病斑直徑會隨著脅迫時間的延長而增大,轉基因型煙草病斑直徑小于野生型煙草,且在脅迫 15 d 時,病斑差異顯著。

采用干腐病致病菌接骨木鐮孢和燕麥鐮孢接種轉StPR1基因煙草及野生型煙草葉片,對病斑直徑的變化進行觀察測量(圖11)。結果表明，病斑的直徑隨著時間的延長而增大,且轉基因型煙草病斑顯著小于野生型。

2.7 轉基因煙草的生理指標變化

F.avenaceum-WT.燕麥鐮孢脅迫野生型煙草；F.avenaceum-P35S:StPR1.燕麥鐮孢脅迫轉基因型煙草；F.sambucinum-WT.接骨木鐮孢脅迫野生型煙草；F.sambucinum-P35S: StPR1.接骨木鐮孢脅迫轉基因型煙草。

F.avenaceum-WT.F.avenaceumstress wild type tobacco；F.avenaceum-P35S:StPR1.F.avenaceumstress transgenic tobacco；F.sambucinum-WT.F.sambucinumstress wild type tobacco；F.sambucinum-P35S: StPR1.F.sambucinumstress transgenic tobacco.

圖11 馬鈴薯主要致病真菌脅迫下野生型煙草和轉基因煙草病斑直徑比較
Fig.11 Comparison of lesion diameters of wild type tobacco and transgenic tobacco under the stress of potato main pathogenic fungal

2.7.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性 在軟腐病致病菌 Ecc、Eca、Ech 和致青枯病致病菌 RS 脅迫處理野生型煙草和轉StPR1基因煙草葉片后,野生型煙草和轉基因煙草葉片中 SOD 的活性會隨著細菌脅迫時間的延長而呈現(xiàn)上升趨勢,Ecc、Ech處理的轉基因煙草SOD的活性在12 h后均高于野生型煙草,Eca處理在36,48 h時SOD 的活性野生型高于轉基因煙草,RS處理在36 h前SOD 的活性轉基因煙草高于野生型,在48 h野生型煙草較高(圖12)。

CK-WT.水脅迫野生型煙草；CK-P35S:StPR1.水脅迫轉基因型煙草；Ecc-WT.Ecc 脅迫野生型煙草；Ecc-P35S:StPR1.Ecc 脅迫轉基因型煙草；Eca-WT.Eca 脅迫野生型煙草； Eca-P35S:StPR1.Eca 脅迫轉基因型煙草；Ech-WT.Ech 脅迫野生型煙草；Ech-P35S:StPR1.Ech 脅迫轉基因型煙草；RS-WT.RS 脅迫野生型煙草；RS-P35S:StPR1.RS 脅迫轉基因型煙草。圖14,16同。

CK-WT.Water stress wild type tobacco；CK-P35S:StPR1.Water stress transgenic tobacco； Ecc-WT.Ecc stress wild type tobacco；Ecc-P35S:StPR1.Ecc stress transgenic tobacco；Eca-WT. Eca stress wild type tobacco；Eca-P35S:StPR1.Eca stress transgenic tobacco；Ech-WT.Ech stress wild type tobacco；Ech-P35S:StPR1.Ech stress transgenic tobacco；RS-WT.RS stress wild type tobacco；RS-P35S:StPR1.RS stress transgenic tobacco.The same as Fig.14,16.

圖12 馬鈴薯主要致病細菌脅迫下野生型煙草和轉基因煙草的超氧化物歧化酶活性的變化 Fig.12 Changes of superoxide dismutase activity in wild type tobacco and transgenic tobacco under the stress of potato mainly pathogenic bacteria

采用干腐病致病菌接骨木鐮孢和燕麥鐮孢處理野生型煙草和轉StPR1基因煙草葉片后,轉基因煙草葉片中 SOD 的活性會隨著真菌脅迫時間延長而呈現(xiàn)上升趨勢,并且轉基因型煙草 SOD 的活性均高于野生型煙草(圖13)。

CK-WT.水脅迫野生型煙草；CK-P35S:StPR1.水脅迫轉基因型煙草；F.avenaceum-WT.燕麥鐮孢脅迫野生型煙草；F.avenaceum-P35S:StPR1.燕麥鐮孢脅迫轉基因型煙草；F.sambucinum-WT.接骨木鐮孢脅迫野生型煙草；F.sambucinum-P35S:StPR1.接骨木鐮孢脅迫轉基因型煙草。圖15,17同。

CK-WT.Water stress wild type tobacco；CK-P35S:StPR1.Water stress transgenic tobacco；F.avenaceum-WT.F.avenaceumstress wild type tobacco；F.avenaceum-P35S:StPR1.F.avenaceumstress transgenic tobacco；F.sambucinum-WT.F.sambucinumstress wild type tobacco；F.sambucinum-P35S:StPR1.F.sambucinumstress transgenic tobacco.The same as Fig.15,17.

圖13 馬鈴薯主要致病真菌脅迫下野生型煙草和轉基因煙草的超氧化物歧化酶活性的變化
Fig.13 Changes of superoxide dismutase activity in wild type tobacco and transgenic tobacco under the stress of potato main pathogenic fungal

2.7.2 過氧化物酶(Peroxidase,POD)活性 在軟腐病致病菌 Ecc、Eca、Ech 和致青枯病致病菌 RS 脅迫處理野生型煙草和轉StPR1基因煙草葉片后,轉基因煙草葉片中 POD 的活性會隨著 4 種致病菌脅迫時間延長而呈現(xiàn)上升趨勢,在每種處理的各個時間段轉基因煙草的POD活性都比野生型煙草高(圖14)。

采用干腐病致病菌接骨木鐮孢和燕麥鐮孢處理野生型煙草和轉StPR1基因煙草葉片后,轉基因煙草葉片中 POD 的活性會隨著致病菌脅迫時間延長而呈現(xiàn)上升趨勢,轉基因煙草的CAT活性均高于野生型煙草，結果表明,轉StPR1基因煙草具有較強的 POD 活性(圖15)。

圖14 馬鈴薯主要致病細菌脅迫下野生型煙草和轉基因煙草的過氧化物酶活性的變化Fig.14 Changes of peroxidase activity in wild type tobacco and transgenic tobacco under the stress of potato mainly pathogenic bacteria

圖15 馬鈴薯主要致病真菌脅迫下野生型煙草和轉基因煙草的過氧化物酶活性的變化Fig.15 Changes of peroxidase activity in wild type tobacco and transgenic tobacco under the stress of potato main pathogenic fungal

2.7.3 過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性 在軟腐病致病菌 Ecc、Eca、Ech 和致青枯病致病菌 RS 脅迫處理野生型煙草和轉StPR1基因煙草葉片后,野生型煙草和轉基因煙草葉片中 CAT 的活性會隨著 4 種致病菌脅迫時間延長而呈現(xiàn)上升趨勢,且在每種處理的各個時間段轉基因煙草的CAT的活性都比野生型煙草高(圖16)。

圖16 馬鈴薯主要致病細菌脅迫下野生型煙草和轉基因煙草的過氧化氫酶活性的變化Fig.16 Changes of catalase activity in wild type tobacco and transgenic tobacco under the stress of potato mainly pathogenic bacteria

采用干腐病致病菌接骨木鐮孢和燕麥鐮孢處理野生型煙草和轉StPR1基因煙草葉片后,轉基因煙草葉片中 CAT 的活性會隨著致病菌脅迫時間延長而呈現(xiàn)上升趨勢,轉基因煙草的CAT活性均高于野生型煙草，結果表明,轉StPR1基因煙草的 CAT 活性更強(圖17)。

圖17 馬鈴薯主要致病真菌脅迫下野生型煙草和轉基因煙草的過氧化氫酶活性的變化Fig.17 Changes of catalase activity in wild type tobacco and transgenic tobacco under the stress of potato main pathogenic fungal

3 討論

近年來,PRs基因已經成為植物抗病相關基因研究的熱點,該基因的表達及功能分析是重要的研究內容[14]。相關轉錄研究表明,正常植株中,PRs基因顯示基礎水平表達,但在真菌感染后該表達水平顯著提升[15]。Zhang等[16]使用實時定量 RT-PCR 對小麥基因TaPR10表達量的變化進行分析,發(fā)現(xiàn)TaPR10在接種后 12 h上調,并且在 24 h 表達量達到了峰值,結果表明TaPR10可能參與小麥抗條銹病防御反應。張計育等[17]克隆獲得平邑甜茶MhPR8基因,其含有保守的構建結構域,屬于Ⅲ類幾丁質酶。qRT-PCR 結果表明,該基因在 SA 誘導下表達量上調,在參與 SA 通路抗生物和非生物脅迫中發(fā)揮關鍵作用。Sarowar等[18]研究發(fā)現(xiàn),辣椒體內的CABPR1基因在乙烯利治療創(chuàng)傷和煙草花葉病毒感染后被強烈誘導,其在煙草植物中的過量表達,不僅增強了對重金屬脅迫的耐受性,而且還增強了對疫霉菌和細菌病原體的耐受性。Shi等[19]發(fā)現(xiàn)棉花中的GhWRKY39-1被生物脅迫所誘導,獲得該轉基因植物后發(fā)現(xiàn),該基因可以提高 PR基因的表達水平,同時 CAT 和 SOD 等酶的活性升高,使得轉基因植物具有較高的耐鹽性。喬子辰[20]研究發(fā)現(xiàn),將水稻中白葉枯病菌的hpa1xoo基因轉入棉花,獲得轉基因棉,在接種黃萎病菌時,轉基因植株體內的 POD 等防御酶活性明顯升高,并且直接參與到轉基因棉的抗脅迫反應。

在本研究中,將馬鈴薯的病程相關蛋白基因StPR1,借助葉盤轉化法導入煙草中,并對轉基因煙草在馬鈴薯主要致病細菌 Ecc、Eca、Ech、RS 及致病真菌接骨木鐮孢和燕麥鐮孢脅迫下進行抗病性及 POD、SOD、CAT 生理指標的分析,發(fā)現(xiàn)與野生型煙草相比較,轉基因煙草對于致病細菌和致病真菌具有更強的抗性。該基因在其他功能作用的研究尚不足,有待進一步的研究。