牛艷麗,賈明珠,韓 栓,付佳苗,劉凌云

(河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,植物逆境生物學(xué)重點實驗室,河南 開封 475004)

土壤鹽脅迫是影響作物產(chǎn)量的重要因素之一。高鹽導(dǎo)致根系吸水困難及Na+和Cl-過度積累,最終抑制植物生長,降低作物產(chǎn)量。為減少鹽脅迫影響,植物已經(jīng)在形態(tài)、生理及生化上進化出一系列的應(yīng)對策略。鹽脅迫發(fā)生時,處于營養(yǎng)生長階段的玉米(Zeamays)水分吸收受影響,生長明顯變緩,老葉中Na+積累,葉片組織壞死[1]；處于生殖生長階段的玉米籽粒發(fā)育受影響,胚和胚乳發(fā)育被抑制,成熟籽粒數(shù)量明顯下降,最終導(dǎo)致減產(chǎn)[2]。

植物對鹽脅迫的反應(yīng)是一個涉及多種功能蛋白和調(diào)節(jié)蛋白共同參與的動態(tài)調(diào)控過程[3]。典型的調(diào)節(jié)蛋白主要是轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶及小G蛋白等分子。其中,小G蛋白Rab是一類協(xié)調(diào)囊泡轉(zhuǎn)運參與多個生物與非生物脅迫響應(yīng)的“分子開關(guān)”。研究發(fā)現(xiàn),鹽脅迫能夠誘導(dǎo)冰葉日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)Mcrab5[4]、谷類植物(Pennisetumglaucum)PgRab7[5]、鹽生植物(Aeluropuslagopoides)AlRab7[6]和鷹嘴豆(Cicerarietinum)CaRabC[7]基因的表達。其中,煙草和水稻中超表達PgRab7都表現(xiàn)出更耐鹽和耐旱的特征[5, 8]；超表達AtRab7的擬南芥耐鹽和耐滲透脅迫能力也得到了增強[9]；超表達OsRab7的水稻轉(zhuǎn)基因植株也更耐鹽、耐熱和耐旱[10]；此外,Rab2基因也參與了小麥抗葉銹病反應(yīng)[11]。這些研究結(jié)果表明,Rab基因在植物生物與非生物脅迫響應(yīng)中的功能可能是保守而多樣的。

玉米是世界范圍內(nèi)的主要糧食作物,其產(chǎn)量受氣候條件,尤其是干旱、鹽脅迫的制約。迄今為止,玉米中Rab蛋白還沒有鑒定,其功能研究進行得更少。擬南芥AtRab6(與酵母ScRab6氨基酸序列同源性為78%)能夠回補酵母溫度敏感型ScRab6缺失突變體[12],說明真核生物中Rab蛋白功能比較保守。本研究通過生物信息學(xué)、基因表達分析及鹽脅迫下酵母生長試驗發(fā)現(xiàn),ZmRab7響應(yīng)多種非生物脅迫過程,異源表達ZmRab7的酵母表現(xiàn)出鹽敏感表型,說明ZmRab7參與了玉米鹽脅迫響應(yīng)過程,為進一步揭示玉米Rab類基因在非生物脅迫信號途徑中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

玉米(B73自交系)種子經(jīng)75%乙醇消毒后播于培養(yǎng)缽(土與蛭石比為1∶1)內(nèi),放培養(yǎng)箱(16 h光/8 h暗,28 ℃)中培養(yǎng)。待幼苗長至三葉時取地上部分,液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米總RNA的提取及cDNA合成 采用TRIzol法提取玉米樣品中的總RNA[13]。提取完成后,使用Prime Script RT reagent Kit(寶生物,大連)試劑盒將提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.2.2 玉米ZmRab7序列分析 以擬南芥AtRab7(G3f)蛋白序列為query從https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/網(wǎng)站Blast得到序列同源性最高的玉米Rab蛋白(GRMZM2G044368),命名為ZmRab7；從NCBI網(wǎng)站分別下載單子葉及雙子葉代表性植物Rab7蛋白氨基酸序列；使用DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對及同源性分析,采用MEGA X軟件(Neighbor-joining method)構(gòu)建進化樹。在https://fold.weizmann.ac.il/fldbin/findex及https://www.predictprotein.org網(wǎng)站上進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)在線分析,三級結(jié)構(gòu)預(yù)測則采用同源建模的方法在Swiss-Model上完成。利用PlantCARE進行植物脅迫響應(yīng)順式作用元件的分析。

1.2.3 玉米ZmRab7基因表達分析 從www.maizegdb.org/gene下載RNA-seq數(shù)據(jù)進行ZmRab7組織特異性表達分析,其中根、莖、葉均選擇玉米三葉期幼苗相應(yīng)組織,基因表達水平根據(jù)FPKM(Fragments per kilobase of exon model per million mapped reads)數(shù)值進行計算。另從https://bar.utoronto.ca/efp_maize/獲取玉米不同脅迫條件下的ZmRab7基因表達數(shù)據(jù)。

1.2.4 玉米ZmRab7基因的克隆及酵母表達載體的構(gòu)建 在前期序列比對分析的基礎(chǔ)上,確定玉米ZmRab7(GRMZM2G044368)基因為研究對象。據(jù)此序列設(shè)計構(gòu)建酵母表達載體引物：F為5′-ATAGG TACCATGGCCTCGCGCCGCCGCAC-3′；R為5′-GGG CTCGAGTTAACAGCACCCGGATGATC-3′。以上述cDNA為模板擴增ZmRab7基因CDS,PCR產(chǎn)物經(jīng)測序驗證正確后重組入pYES2載體中,再次測序正確后轉(zhuǎn)入釀酒酵母INVSC1菌株中備用。

1.2.5 酵母生長試驗 將含有ZmRab-pYES2重組質(zhì)粒的酵母菌株液體培養(yǎng)至對數(shù)生長期,誘導(dǎo)表達6 h后將其濃度調(diào)整至OD600=1.0,將調(diào)整好的菌液分別按照1,1∶10,1∶100,1∶1 000,1∶10 000的比例梯度稀釋。隨后分別取1 μL點到含150 mmol/L或300 mmol/L NaCl的YPD固體培養(yǎng)基(含10%半乳糖和10%棉子糖)上,30 ℃培養(yǎng),2 d后觀察并記錄結(jié)果。設(shè)置空白對照組,將含有pYES2空質(zhì)粒的酵母菌,按照上述步驟同步進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米ZmRab7的鑒定及進化關(guān)系分析

以擬南芥AtRab7蛋白序列為query在https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/網(wǎng)站Blast,找到并下載與之同源性最高的玉米ZmRab7蛋白序列。DNAMAN序列比對顯示,ZmRab7與雙子葉植物擬南芥、花生、楊樹、番茄及葡萄Rab7氨基酸序列同源性分別為89.37%，86.96%，87.92%，88.41%和88.41%；與單子葉植物水稻、高粱和短柄草Rab7氨基酸序列同源性分別為97.58%，99.52%，97.10%?？梢钥闯?ZmRab7蛋白明顯地和單子葉植物Rab7序列一致性高,其中序列相似性最高的是高粱SbRab7蛋白。已知Rab蛋白具有4個(G1：GDSGVGKT；G3：WDTAGQ；G4：GNKXD；G5：ETSAK)與GTP酶活性密切相關(guān)的基序和一個G2(YKATIGADF)效應(yīng)器基序,位于蛋白質(zhì)C末端的2個半胱氨酸殘基是潛在異戊烯化修飾位點,該位點和Rab蛋白與膜的附著及囊泡運輸功能相關(guān)。隨后的氨基酸序列分析中也發(fā)現(xiàn),玉米ZmRab7含有Rab蛋白保守的G1、G2、G3、G4和G5序列,并且其C末端也含有2個保守的Cys殘基(圖1)。這些結(jié)果暗示,通過序列比對找到的ZmRab7蛋白可能會具有類似于擬南芥AtRab7通過水解GTP參與囊泡融合及轉(zhuǎn)運的能力。

圖1 玉米與其他植物Rab7氨基酸序列比對Fig.1 Sequence alignment of ZmRab7 with Rab7 proteins of other species

為進一步說明Rab7在玉米及不同植物進化中的親緣關(guān)系,利用MEGA X對不同來源Rab7蛋白進行了進化樹的構(gòu)建。在選取的9種代表性植物中,很顯然,Rab7蛋白在進化中按照單、雙子葉物種的不同分為2類,其中楊樹(Populustrichocarpa)、葡萄(Vitisvinifera)、大豆(Glycinemax)、番茄(Solanumlycopersicum)及擬南芥(Arabidopsisthaliana)Rab7蛋白歸為一類,短柄草(Brachypodiumdistachyon)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)和高粱(Sorghumbicolor)歸為另一類,與玉米ZmRab7親緣關(guān)系最近的是高粱的SbRab7(圖2),暗示在進化中它們有共同的祖先,并且進化的時間也非常相近。

圖2 ZmRab7與其他同源蛋白間的進化關(guān)系Fig.2 Phylogenetic relationship of ZmRab7 and other homologous proteins

2.2 ZmRab7蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)無序化區(qū)域是一類連接保守結(jié)構(gòu)的柔性部位,與有序折疊結(jié)構(gòu)相比,前者在蛋白質(zhì)進化中其氨基酸殘基更容易被更換。FoldIndex軟件序列分析顯示,ZmRab7有2個無序化區(qū)域且位于蛋白質(zhì)的C末端(圖3-A),占氨基酸殘基總數(shù)的21.36%(44/206),這說明不同的Rab蛋白之間,其C末端是高度可變區(qū),該區(qū)是Rab蛋白翻譯后異戊烯化修飾的位點。此外,https://www.predictprotein.org網(wǎng)站分析結(jié)果也顯示，ZmRab7二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占28.64%,β-折疊占20.87%,突環(huán)/無規(guī)卷曲則占整個結(jié)構(gòu)的一半(50.49%),突環(huán)/無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)往往是蛋白質(zhì)活性部位所在的區(qū)域(圖3-B)。這些結(jié)果進一步說明ZmRab7在玉米中應(yīng)該是一個有Rab活性的功能分子。

2.3 ZmRab7蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

Rab是一類超家族小G蛋白,該類蛋白質(zhì)在結(jié)合GTP的活性狀態(tài)和結(jié)合GDP的失活狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換。當(dāng)其結(jié)合GTP時,Rab蛋白與膜系統(tǒng)及效應(yīng)器分子結(jié)合,起著傳遞信號、調(diào)節(jié)囊泡融合的作用。為進一步分析ZmRab7是否具有小G蛋白的功能,通過SWISS-MODEL同源建模對ZmRab7蛋白三級結(jié)構(gòu)進行在線分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ZmRab7蛋白的三級結(jié)構(gòu)由4個α螺旋和多個β-折疊及無規(guī)卷曲組成；保守的G1、G2、G3、G4和G5區(qū)域位于該蛋白質(zhì)一個相對集中的區(qū)域,具有明顯的結(jié)構(gòu)域特征；與已知功能的擬南芥AtRab7的三級結(jié)構(gòu)非常相似(圖4)。已知Rab蛋白G1、G3-G5區(qū)是其識別、結(jié)合、水解GTP的區(qū)域,G2區(qū)是結(jié)合效應(yīng)器分子向下游傳遞信號的區(qū)域。因此,這些結(jié)果暗示ZmRab7在生化上可能具有類似AtRab7的小G蛋白屬性,有可能通過水解GTP傳遞或者響應(yīng)細胞信號。

A. ZmRab7蛋白折疊狀態(tài)分析；B. ZmRab7蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。A. Analysis of the folding state of ZmRab7; B. Prediction of the ZmRab7 secondary structure.

圖4 ZmRab7和AtRab7蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Predicted tertiary structures of ZmRab7 and AtRab7

2.4 玉米不同組織中ZmRab7基因的表達譜分析

AtRab5和AtRab7均參與了擬南芥根系發(fā)育的調(diào)控[14-15],基于玉米RNA-seq的FPKM數(shù)值[16],對玉米B73自交系的根、莖、葉、雄穗、花絲、花藥和幼胚等組織進行基因表達剖析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ZmRab7基因在玉米的各個組織中均有表達,在根及幼胚中表達量較高,在雄穗中表達量最低(僅是根中表達量的1/2)(圖5),暗示ZmRab7基因參與了玉米各個組織發(fā)育的調(diào)控,但更多作用于根及幼胚的發(fā)育過程。

2.5 玉米ZmRab7參與非生物脅迫響應(yīng)的功能分析

植物Rab蛋白作為一個胞內(nèi)信號分子參與了多種生長發(fā)育及脅迫響應(yīng)的調(diào)節(jié)過程。為進一步解析ZmRab7可能的生物學(xué)功能,利用PlantCARE分析了玉米ZmRab7基因啟動子序列鹽脅迫相關(guān)的順式作用元件。結(jié)果發(fā)現(xiàn),玉米ZmRab7基因上游2 000 bp序列含有4個GT1GMSCAM4(GAAAAA,分別位于-254,-640,-785,-1 045 bp處)和2個DRECRTCOREAT(RCCGAC,分別位于-697,-1 386 bp處)元件,這2種保守序列均是與鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件,暗示ZmRab7基因可能參與了玉米鹽脅迫響應(yīng)的調(diào)節(jié)過程。

圖5 玉米ZmRab7基因的組織特異性表達模式Fig.5 Tissue expression pattern of ZmRab7 in maize

接下來,基于RNA-seq數(shù)據(jù)[17]分析了玉米B73中ZmRab7基因在模擬干旱(PEG8000處理)、低溫(5 ℃)、高溫(50 ℃)及高鹽(NaCl處理)等非生物脅迫處理下的響應(yīng)情況。如圖6所示,不同的干旱脅迫處理能夠誘導(dǎo)ZmRab7基因的表達,但低溫及高溫處理均顯著下調(diào)該基因的表達,高鹽處理只是輕微抑制其表達(對照組基因表達量為161.21,試驗組為158.16)。這些試驗結(jié)果說明,玉米ZmRab7基因的確參與了干旱、極端溫度及鹽害等非生物脅迫響應(yīng)過程,進而使其更好地適應(yīng)各種各樣的不利環(huán)境。

圖6 不同脅迫處理下玉米ZmRab7的基因表達Fig.6 Expression levels of ZmRab7 gene withdifferent stress treatments in maize

通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建基因敲除或超表達植株是鑒定基因功能最好的辦法[18-19],但玉米基因組比較大(B73基因組為2 106 Mb,水稻基因組為430 Mb),且遺傳轉(zhuǎn)化周期比較長,為了能快速證明ZmRab7在生物體內(nèi)是否參與非生物脅迫響應(yīng)過程,將玉米ZmRab7基因的CDS序列克隆到pYES2載體上,并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入INVSC1酵母細胞中,同時將pYES2空載體轉(zhuǎn)入同樣的酵母細胞作為對照,觀察不同酵母株系在NaCl處理下的生長情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)OD600<0.001時,與對照相比,ZmRab7-pYES2轉(zhuǎn)基因酵母對NaCl(150,300 mmol/L)脅迫處理非常敏感,可以看到只有很少的酵母細胞在培養(yǎng)基上生長。事實上,當(dāng)OD600=0.1,ZmRab7-pYES2酵母已經(jīng)表現(xiàn)出不耐鹽的表型(圖7)。因此,玉米非生物脅迫表達分析及酵母生長試驗結(jié)果均顯示,ZmRab7基因介導(dǎo)了鹽脅迫及其他脅迫的響應(yīng)過程。

圖7 不同濃度NaCl脅迫處理對ZmRab7-pYES2轉(zhuǎn)化酵母生長的影響Fig.7 Effects of NaCl stress with different concentrations on the growth of ZmRab7-pYES2 yeast transformant strains

3 結(jié)論與討論

真核生物主要通過質(zhì)膜上受體或者感受子識別并傳遞環(huán)境信號。截至目前,酵母、哺乳動物及擬南芥細胞中參與質(zhì)膜融合調(diào)節(jié)的Rab蛋白已經(jīng)研究得比較清楚,但玉米中Rab類小G蛋白的功能研究還非常少見。玉米作為一種主要糧食作物,其對不利條件環(huán)境的耐受能力會嚴(yán)重影響最終產(chǎn)量。因此,ZmRab7的研究對于解析玉米通過囊泡運輸調(diào)節(jié)介導(dǎo)特定的環(huán)境響應(yīng)顯得尤為重要。

自然界中Rab蛋白因其成員眾多而組成小G蛋白超家族,其序列和功能都比較保守[20-23]。本研究通過擬南芥AtRab7蛋白序列比對并克隆到玉米ZmRab7基因,序列分析及進化樹構(gòu)建都顯示,ZmRab7蛋白不僅與其他植物Rab蛋白同源性非常高(最高達99.52%),同時還具有該類蛋白質(zhì)典型的序列特征和特定的保守位點及相似的高級結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果都暗示,ZmRab7蛋白在植物體內(nèi)可能作為一個小G蛋白類分子開關(guān),通過參與類似于AtRab7介導(dǎo)的囊泡運輸和質(zhì)膜融合過程響應(yīng)外界環(huán)境信號。

植物中不同的Rab基因可能介導(dǎo)不同的發(fā)育與非生物脅迫響應(yīng)過程。ZmRab7在玉米的根及幼胚中表達量較高,暗示ZmRab7可能參與了玉米根系及胚的發(fā)育調(diào)控及信號響應(yīng)。玉米rab17[23]、rab28[24]都能夠被ABA誘導(dǎo)表達。OsRab7超表達轉(zhuǎn)基因水稻和AtRab7超表達轉(zhuǎn)基因擬南芥在苗期生長階段均展現(xiàn)出耐鹽的特征[9-10]。然而,本研究表明,玉米ZmRab7基因含有鹽脅迫響應(yīng)元件,其表達受高鹽抑制；與此相一致的是,ZmRab7轉(zhuǎn)基因酵母表現(xiàn)出不耐鹽表型。這些結(jié)果說明了鹽脅迫調(diào)控機制的復(fù)雜性,同時也說明不同植物Rab7基因?qū)}脅迫處理做出的響應(yīng)可能不同,因此,進一步詳細解析玉米ZmRab7對鹽脅迫響應(yīng)的詳細分子機制，有助于將來利用分子育種手段提高玉米抗非生物脅迫的能力并進行品種改良。