申浩冉,白 輝,任世龍,王 璐,王永芳,全建章,董志平,李志勇

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 谷子研究所,國(guó)家谷子改良中心,河北省雜糧重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 石家莊 050035)

谷瘟病為灰梨孢菌(Magnaportheoryzae)侵染谷子引起的一種真菌性病害,是目前谷子上重要的氣傳流行性病害[1],該病害流行時(shí)對(duì)谷子產(chǎn)量影響很大,發(fā)病嚴(yán)重時(shí)某些感病品種甚至絕收[2],抗谷瘟品種選育和種植是防治該病害最簡(jiǎn)單和有效的方法[3]。谷瘟病菌的無(wú)毒基因與谷子抗病基因互作與稻瘟病菌和水稻抗病基因互作機(jī)制相同,都遵循基因?qū)蚣僬f(shuō)[4]。當(dāng)水稻所含有的抗病基因產(chǎn)物與稻瘟病菌無(wú)毒基因產(chǎn)物發(fā)生直接或間接的相互識(shí)別,可引發(fā)寄主發(fā)生過(guò)敏性壞死反應(yīng)(HR),誘導(dǎo)水稻抗性產(chǎn)生起到抗病作用[5-6],但無(wú)毒基因經(jīng)常發(fā)生變異[7],使得抗性品種在種植幾年后抗病性衰退[8]。因此,對(duì)不同地區(qū)谷瘟病菌無(wú)毒基因進(jìn)行檢測(cè),明確不同地區(qū)谷瘟病菌無(wú)毒基因類型及其變異機(jī)制,可為深入研究谷瘟病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)及其無(wú)毒基因變異機(jī)制奠定基礎(chǔ)。到目前為止,已經(jīng)克隆了多個(gè)稻瘟病菌無(wú)毒基因,如Avr1-CO39[9]、Avr-pita[10]、ACE1[11]、AvrPiz-t[12]、Avr-pii[13]、Avr-pia和Avr-pik等,除Avr1-CO39分離自寄主彎葉畫眉草外,其余均分離自水稻。PWL家族屬于寄主特異性無(wú)毒基因,目前PWL1與PWL2被證明具有無(wú)毒基因功能,控制稻瘟病菌對(duì)彎葉畫眉草的致病性[14-15]。穆慧敏等[16]通過(guò)設(shè)計(jì)PWL基因家族成員的特異性引物PCR擴(kuò)增,證明PWL1基因僅存在牛筋草中,而寄主為水稻的稻瘟病菌中未發(fā)現(xiàn)PWL1基因,部分菌株存在PWL2基因。

至今,關(guān)于我國(guó)谷瘟病菌中PWL無(wú)毒基因家族的分布和變異的研究還未見報(bào)道,本研究通過(guò)設(shè)計(jì)PWL基因特異性引物對(duì)不同地區(qū)來(lái)源的252株谷瘟病菌進(jìn)行擴(kuò)增分析,以期了解PWL家族在谷瘟病菌群體的分布及變異,為進(jìn)一步研究谷瘟病菌與谷子的互作機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

本試驗(yàn)中供試谷瘟病菌單孢菌株均分離自田間具有典型谷瘟病癥狀的樣本,利用干燥濾紙片法在冰箱-20 ℃冷凍保存,菌株信息來(lái)源見表1。

1.2 谷瘟病菌活化培養(yǎng)和菌絲DNA提取

表1 252個(gè)谷瘟病菌供試菌株Tab.1 252 isolates of Magnaportheoryzae from foxtail millet

將凍存的谷瘟病菌濾紙片放置到PDA平板上進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)7 d后挑取菌落邊緣幼嫩菌餅接種到液體PDA培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)7 d后用滅菌紗布收集菌絲體,用濾紙吸干多余水分。采用常規(guī)CTAB法提取谷瘟病菌菌絲體DNA,提取DNA樣本檢測(cè)合格后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)

參考穆慧敏等[16]設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增PWL1、PWL3和PWL4基因的特異性引物,從NCBI網(wǎng)站下載稻瘟病菌的PWL無(wú)毒基因家族相關(guān)基因核苷酸序列,根據(jù)PWL2與PWL3基因的核苷酸序列,通過(guò)Primer 5生物信息學(xué)軟件設(shè)計(jì)這2個(gè)基因的檢測(cè)引物,在上海生工合成相關(guān)引物。具體的引物信息見表2。

表2 PWL基因家族擴(kuò)增引物序列Tab.2 Primers sequences for amplification of PWL gene family

1.4 無(wú)毒基因擴(kuò)增與測(cè)序分析

PCR反應(yīng)總體系25 μL:2×ExTaqMaster Mix 12.5 μL(康為世紀(jì)),上游引物0.5 μL,下游引物0.5 μL,DNA模板 2 μL,ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增步驟:94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共35次循環(huán)；最后72 ℃充分延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后EB染色觀察。用手術(shù)刀切取目的條帶后用膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物,純化后的產(chǎn)物與pMD19-T 載體 16 ℃連接過(guò)夜,通過(guò)熱激法把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,復(fù)蘇培養(yǎng)后涂布到氨芐青霉素LB平板上,挑取單克隆通過(guò)PCR法對(duì)克隆進(jìn)行檢測(cè),把陽(yáng)性克隆保存在甘油后郵寄到上海生工進(jìn)行測(cè)序分析。采用DNAMAN 6.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PWL基因家族的PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

利用5對(duì)PWL無(wú)毒基因引物對(duì)252株谷瘟病菌DNA進(jìn)行檢測(cè),擴(kuò)增結(jié)果表明:PWL基因家族在谷瘟病菌中存在變異,變異的形式主要為基因的缺失和插入。252株谷瘟病菌都未擴(kuò)增出PWL1基因的特異性目的片段,說(shuō)明谷瘟病菌菌株不含PWL1基因。65個(gè)谷瘟病菌菌株擴(kuò)增出無(wú)毒基因PWL2的特異性目的片段,擴(kuò)增率為25.8%。而無(wú)毒基因PWL4和PWL3擴(kuò)增率均為100%,但無(wú)毒基因PWL3的擴(kuò)增片段相較于目的片段超出849 bp,部分菌株無(wú)毒基因PWL家族擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。

M.Marker；CK.陰性對(duì)照(ddH2O)；1-16.谷瘟病菌分離物。M.DNA size Marker; CK.Negative control(ddH2O); 1-16.Strain 1-16. Magnaporthe oryzae from foxtail millet.

2.2 無(wú)毒基因PWL2序列變異分析

對(duì)65個(gè)谷瘟病菌菌株的無(wú)毒基因PWL2的擴(kuò)增條帶進(jìn)行膠回收,并進(jìn)行克隆測(cè)序。首先利用Chromas 2.6.4軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行人工比對(duì)校正,然后利用Clustalx 2.0軟件對(duì)校正后的序列進(jìn)行比對(duì)分析,比對(duì)結(jié)果通過(guò)DnaSP 5.0軟件進(jìn)行單倍型多樣性分析,利用DNAMAN 6.0對(duì)不同單倍型的谷瘟病菌菌株無(wú)毒基因PWL2的核苷酸序列和編碼的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果表明(圖2,3),谷瘟病菌無(wú)毒基因PWL2共劃分為14個(gè)單倍型,分別命名為P1～P14(GenBank登錄號(hào):MG787153～MG787166)。以參考序列(U26313.1)為外群,利用NETWORK 5.0生物信息學(xué)軟件構(gòu)建谷瘟病菌PWL2的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖,從圖4可以看出優(yōu)勢(shì)單倍型為P1,共包含46個(gè)菌株,占65個(gè)谷瘟病菌菌株的70.8%,以此為基礎(chǔ)衍生出其他主要單倍型,其次為單倍型P12共包含7株谷瘟病菌,黑龍江地區(qū)2株、河南地區(qū)4株及遼寧地區(qū)1株,其余單倍型均包含單一菌株,河北、河南、山西、陜西、遼寧、黑龍江等地區(qū)均有特異性單倍型,以河南地區(qū)單倍型種類最多,包含6種,說(shuō)明總體上谷瘟病菌種群具有較高的遺傳多樣性。

圖2 供試菌株的PWL2序列比對(duì)Fig.2 Sequence comparison analysis of PWL2 gene among partial isolates

圖3 不同菌株間PWL2編碼氨基酸序列比對(duì)Fig.3 Comparison of multiple amino acid sequences of PWL2 gene among different isolates

彩色餅圖的面積反映了單倍型的數(shù)量；彩色段代表了在每個(gè)區(qū)域中發(fā)生相同單倍型的比例。The area of the color pie indicates the number of haplotype and color segments reflects the proportion of different groups in each haplotype.

2.3 谷瘟病菌與稻瘟病菌無(wú)毒基因PWL3序列差異

利用引物PWL3-1/PWL3-2對(duì)隨機(jī)挑選的11株谷瘟病菌和11株稻瘟病菌進(jìn)行擴(kuò)增,電泳檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。谷瘟病菌無(wú)毒基因PWL3序列比預(yù)期目的條帶大850 bp左右,隨機(jī)挑選6個(gè)菌株的無(wú)毒基因PWL3擴(kuò)增序列進(jìn)行回收克隆測(cè)序,通過(guò)NCBI在線比對(duì)分析表明，在基因編碼區(qū)插入849 bp的核苷酸片段,與non-LTR retrotransposon：MGL的相似度達(dá)到96.7%。利用谷瘟病菌與稻瘟病菌的PWL3基因的差異,通過(guò)特異性引物可以從分子水平上快速區(qū)分谷瘟病菌與稻瘟病菌。

3 結(jié)論與討論

在禾本科植物中,寄主為水稻的稻瘟病菌無(wú)毒基因的相關(guān)報(bào)道較多,其中以品種特異性無(wú)毒基因的變異及群體遺傳多樣性的研究居多,關(guān)于PWL無(wú)毒基因家族的變異分析較少,而谷子中谷瘟病菌無(wú)毒基因的研究更是鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)5對(duì)特異性引物對(duì)谷瘟病菌PWL無(wú)毒基因家族成員進(jìn)行擴(kuò)增,探尋其在不同谷瘟病菌菌株的分布及變異情況。

M.Marker；CK.陰性對(duì)照(ddH2O)；1-11.稻瘟病菌菌株的DNA；12-22.谷瘟病菌菌株的DNA。M.Marker; CK.Negative contro1(ddH2O); 1-11.Strain 1-11 of Magnaporthe oryzae from rices; 12-22.Strain 12-22 of Magnaporthe oryzae from foxtail millet.

穆慧敏等[16]研究表明,稻瘟病菌中不存在PWL1無(wú)毒基因,而寄主為牛筋草的稻瘟病菌中卻存在PWL1無(wú)毒基因,根據(jù)兩者的差異,利用PCR擴(kuò)增即可在分子水平上快速區(qū)分不同寄主的灰梨孢菌。本研究發(fā)現(xiàn)谷瘟病菌中同樣不含有PWL1無(wú)毒基因,可以用于區(qū)分寄主分別為谷子和牛筋草的灰梨孢菌。任世龍等[17]研究不同谷瘟病菌菌株IGS序列時(shí)發(fā)現(xiàn)谷瘟病菌與稻瘟病菌的IGS序列存在差異,但因序列相差較小,普通瓊脂糖電泳難以區(qū)分,必須通過(guò)測(cè)序才能從分子水平上進(jìn)行區(qū)分。本研究發(fā)現(xiàn)，谷瘟病菌的PWL3無(wú)毒基因與稻瘟病菌PWL3無(wú)毒基因序列存在非常明顯的差異,具體表現(xiàn)在谷瘟病菌PWL3基因在編碼區(qū)插入849 bp的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子,PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1.0%的普通瓊脂糖凝膠電泳就能快速區(qū)分。

灰梨孢菌具有廣泛的寄主范圍,谷子為其寄主之一,除此，禾本科植物小麥、牛筋草、黑麥草以及水稻也都是其寄主[18]。關(guān)于不同寄主的灰梨孢菌相互之間能否互相侵染還有爭(zhēng)議,Kato等[19]通過(guò)致病性、交配能力和DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性研究表明,每個(gè)植物屬的灰梨孢菌分離物構(gòu)成一個(gè)特定于宿主的子群,具體表現(xiàn)寄主為谷子的谷瘟病菌特異性侵染狗尾草屬的植物,對(duì)水稻不具有侵染性。但杜新法等[20]采用分離自稻田周圍常見的10種雜草上的梨孢菌與分離自水稻上的稻瘟病菌以涂布法做交叉接種,發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌對(duì)田間的牛筋草、狗尾草等雜草具有較弱的致病性,同樣分離自狗尾草的灰梨孢菌對(duì)麗江新團(tuán)黑谷等少數(shù)品種具有致病性,并判斷稻田周圍雜草上的灰梨孢菌在稻瘟病菌的傳播和積累過(guò)程中具有一定作用。傳統(tǒng)谷子種植產(chǎn)區(qū)多分布于華北、西北及東北等地區(qū),而東北地區(qū)和河南部分地區(qū)由于同時(shí)種植谷子與水稻,使得梨孢菌有可能在不同寄主間進(jìn)行傳播。所以快速區(qū)分不同寄主之間的灰梨孢菌對(duì)于研究該菌在不同作物間的傳播及分布,闡明瘟病初侵染源及其寄主分布具有一定的意義。

Kang等[14]研究表明，無(wú)毒基因PWL1與PWL2控制著灰梨孢菌是否對(duì)彎葉畫眉草具有侵染能力。 Sweigard等[15]研究發(fā)現(xiàn)，不同地理來(lái)源的稻瘟病菌菌株無(wú)毒基因PWL2具有較高的多態(tài)性,無(wú)毒基因PWL2易發(fā)生變異,單堿基的變異可造成無(wú)毒基因功能的喪失,進(jìn)而恢復(fù)侵染彎葉畫眉草的能力。Schneider等[21]發(fā)現(xiàn)一種PWL2基因的等位基因PWL2D,該基因與PWL2的主要區(qū)別為第90位的氨基酸由G轉(zhuǎn)變?yōu)镹,該位點(diǎn)變異可導(dǎo)致寄主植物對(duì)病原體喪失識(shí)別能力。

本研究結(jié)果表明,谷瘟病菌中均含有PWL2基因,并存在整個(gè)無(wú)毒基因的缺失和多處單核苷酸變異,通過(guò)DnaSP 5.0軟件單倍型分析發(fā)現(xiàn),谷瘟病菌中PWL2共包含14種單倍型,其中單倍型P1占比70.8%,為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)單倍型,該類型與PWL2D相似,均在第90位氨基酸發(fā)生G到N的突變,但在142位的氨基酸并未發(fā)生C到S的突變,P1單倍型谷瘟病菌能否感染彎葉畫眉草還需進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究嘗試?yán)霉任敛【鶳WL2基因的核苷酸變異來(lái)分析不同地區(qū)谷瘟病菌群體的遺傳結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)病菌群體之間具有共性,比如都包含P1單倍型,谷瘟病菌在各地區(qū)之間可能以某種形式存在一定的交流,同時(shí)不同地區(qū)也存在一些其他地區(qū)并不存在的單倍型,不同地理來(lái)源的谷瘟病菌群體具有差異性,這種共性與差異性的同時(shí)存在說(shuō)明谷瘟病菌不同地區(qū)之間遺傳差異性與地理來(lái)源之間存在較為復(fù)雜的關(guān)系。

綜上所述,本研究以來(lái)自不同地區(qū)的252株谷瘟病菌單孢菌株為試驗(yàn)材料,通過(guò)PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),谷瘟病菌菌株不存在無(wú)毒基因PWL1,部分菌株存在PWL2基因,全部谷瘟病菌均存在PWL3與PWL42個(gè)基因。同時(shí)谷瘟病菌與稻瘟病菌的PWL3基因存在849 bp的差異,基于這種差異可通過(guò)PCR技術(shù)快速區(qū)分谷瘟病菌與稻瘟病菌。谷瘟病菌無(wú)毒基因PWL家族成員的分布及變異分析可為研究谷瘟病菌本身遺傳多樣性,及深入研究不同寄主灰梨孢菌的寄主特異性和灰梨孢菌自然條件下的積累與傳播研究提供參考。