侯丁一,張曉蘿,康立茹,趙 君,張之為

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.呼和浩特市園林科研植保站,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是世界上的第四大食用作物[1],目前已經(jīng)成為最普遍、最重要的非谷類糧食作物,因此,維護(hù)馬鈴薯的安全生產(chǎn)已成為世界糧食安全的重要保障之一。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì),我國2016年的馬鈴薯種植面積達(dá)到了581.51 hm2,年產(chǎn)量達(dá)9 912.24萬t,是世界第一大馬鈴薯生產(chǎn)國[2]。馬鈴薯產(chǎn)業(yè)已經(jīng)發(fā)展成為我國農(nóng)村經(jīng)濟(jì)支柱的產(chǎn)業(yè)之一[3]。但是,由于疫霉菌(Phytophthorainfestans)侵染導(dǎo)致的晚疫病嚴(yán)重發(fā)生,造成馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)的下降,從而制約了我國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4]。每年由于馬鈴薯晚疫病對馬鈴薯造成的減產(chǎn)為10%～20%,病害發(fā)生嚴(yán)重時期減產(chǎn)可高達(dá)50%～70%,甚至絕收[5]。因此,挖掘抗病基因,并利用基因工程手段進(jìn)行抗晚疫病育種,對保障馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的安全具有非常重要的意義[6]。

植物對病原菌侵染的抗性反應(yīng)最初表現(xiàn)為細(xì)胞死亡,稱之為過敏反應(yīng)(Hypersensitive response,HR)[7]；在過敏反應(yīng)發(fā)生后,被侵染植株則會產(chǎn)生抗性,甚至具有了很強(qiáng)的廣譜抗性,稱為系統(tǒng)獲得性抗性(Systemic acquired resistance,SAR)[8]。已有研究表明，H2O2是誘導(dǎo)植物HR反應(yīng)的信號分子之一[9-10],Houot等[9]發(fā)現(xiàn)H2O2具有誘導(dǎo)煙草細(xì)胞程序性死亡的功能。H2O2作為活性氧(Active oxygen,AO)組成中的一員,通過誘發(fā)過敏性壞死反應(yīng),使得植物具有了抵抗病原菌侵染的第一道防線[11]；同時,H2O2的大量積累還可以直接殺死病原菌并且參與植物細(xì)胞壁增厚和木質(zhì)素的合成過程[12]。但是過高濃度的活性氧會對寄主植物造成損傷,而ROS清除酶如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)等則起到平衡植物體中活性氧濃度的作用。SOD是一類含金屬的酶類,可將超氧陰離子歧化為過氧化氫和氧氣。SOD還能去除單線態(tài)氧,防止羥自由基的形成,并且已被認(rèn)為是清除ROS的最基本防御機(jī)制。CAT可將H2O2分解成水和氧氣,而POD活性的增加與木質(zhì)素類物質(zhì)積累以及過敏反應(yīng)的啟動有關(guān)[13-14]。因此,活性氧參與一系列抗病防御反應(yīng),其代謝水平的調(diào)控在植物與病原物互作中扮演著重要的角色[15]。

BAG(Bcl-2 associated athanogene)是一類具有多種功能的蛋白家族,具有與細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生相關(guān)的各種功能[16]。BAG基因的首次發(fā)現(xiàn)于小鼠胚胎cDNA文庫中[17],目前,已經(jīng)確定人類基因組中有6個BAG家族成員,它們可以調(diào)節(jié)多種生理過程,如細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生等[18-19]。而植物中的AtBAG1～AtBAG4的結(jié)構(gòu)與動物中的BAG非常相似,預(yù)示著其功能可能與該同源蛋白在動物中的功能相似[16]。有人認(rèn)為BAG蛋白不僅通過結(jié)合鈣調(diào)蛋白,還可以通過結(jié)合其他的蛋白來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞,使其能夠調(diào)控植物葉片衰老以及對逆境的響應(yīng)等生理過程[20-21],而且在擬南芥的耐寒、抗旱和耐鹽性中都具有一定的功能[22-23]。也有研究表明，BAG蛋白可能與植物的抗病性有關(guān)。為了證實(shí)上述的研究結(jié)果,研究者對敲除AtBAG4和AtBAG6后的擬南芥接種灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea),結(jié)果表明AtBAG4和AtBAG6介導(dǎo)植物對病原菌的防衛(wèi)反應(yīng)[22]。Ghag等[24]在利用香蕉中細(xì)胞凋亡相關(guān)基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因過表達(dá)香蕉植株的過程中發(fā)現(xiàn),過表達(dá)MusaBAG1的轉(zhuǎn)基因香蕉植株對香蕉的枯萎病菌(Fusariumoxysporum)抗性增強(qiáng)。

本研究以馬鈴薯葉片為試驗(yàn)材料,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)體系,分別從接種部位病斑大小的變化、壞死細(xì)胞的數(shù)量、H2O2水平以及ROS清除酶的活性等方面初步探究了馬鈴薯的StBAG3在對晚疫病抗性建立過程中可能具有的功能,此研究結(jié)果為后續(xù)深入研究StBAG3基因在馬鈴薯抗性建立過程中的調(diào)控機(jī)制奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試病原菌：馬鈴薯晚疫菌由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院植物分子病理實(shí)驗(yàn)室保存,其交配型為A1型；供試馬鈴薯材料：人工氣候箱內(nèi)生長30 d的夏坡蒂葉片；供試農(nóng)桿菌：本實(shí)驗(yàn)室存留的含有pCAMBIA1302-GFP-BAG質(zhì)粒和pCAMBIA1302-GFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LB4404菌株[25]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá) 將備好的含有pCAMBIA1302-GFP-BAG超表達(dá)載體與空載體的農(nóng)桿菌菌液室溫靜置3 h后用于接種；用去掉針頭的注射器將含有pCAMBIA1302-GFP-BAG以及空載體的農(nóng)桿菌菌液分別注射到馬鈴薯離體葉片的背面,24 h后人工接種馬鈴薯晚疫病菌的游動孢子液(1×106個/mL)。

1.2.2 病原菌的接種 將在黑麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d的致病疫霉菌轉(zhuǎn)入裝有無菌水的離心管中,4 ℃下放置3 h誘導(dǎo)游動孢子的釋放,將孢子濃度調(diào)至1×106個/mL。在葉片的右側(cè)接種10 μL的孢子液,葉片的左側(cè)接種水作為對照。將接種葉片放置在光照培養(yǎng)箱中(光照16 h,黑暗8 h,溫度為18～22 ℃,濕度為80%)培養(yǎng)。分別在接種后0,24,48,72,96 h測量病斑的面積,并運(yùn)用Motic Images Plus 2.0輔助計(jì)算接種部位相對病斑面積,相對病斑面積/%=接種部位的病斑面積/(0.25×單個葉片面積),接種情況見圖1。

圖1 馬鈴薯離體葉片瞬時表達(dá)StBAG3后接種晚疫菌的示意圖Fig.1 The leaf of potato inoculated with P.infestans after transient expression of StBAG3

1.2.3 染色 采用Zheng等[26]的方法,用臺盼藍(lán)對馬鈴薯葉片進(jìn)行染色；采用Thordal-Christensen等[27]的方法,用DAB對馬鈴薯葉片進(jìn)行染色。

1.2.4 過氧化氫含量的測定 稱取1 g接種馬鈴薯晚疫病菌后0,24,48,72,96 h后瞬時表達(dá)目的基因的葉片,按材料與提取液1∶1的比例加入預(yù)冷的丙酮并研磨后,6 000 r/min離心10 min。取1 mL上清液,加入5%硫酸鈦和濃氨水,待沉淀形成后,6 000 r/min離心10 min,棄上清液。用丙酮洗滌3～5次。加入5 mL 2 mol/L硫酸,待沉淀溶解后,在415 nm波長下測定吸光度。H2O2含量/(μmol/g)=(C×Vt)/(FW×V1),式中,C代表標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的H2O2濃度,Vt代表樣品提取液總體積,V1代表測定時樣品體積,FW代表植物組織鮮質(zhì)量。

1.2.5 ROS清除酶活性測定 SOD活性的測定采用李合生[28]的NBT顯色法,分別在瞬時表達(dá)StBAG3和空載體的葉片上接種馬鈴薯晚疫菌,然后在接種0,24,48,60,72 h后分別取0.1 g新鮮葉片進(jìn)行測定；POD活性的測定采用郝再彬等[29]的愈創(chuàng)木酚法,取樣方法同上；CAT活性的測定采用李合生[28]的方法,取樣方法同上。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析,在α=0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 瞬時表達(dá)StBAG3基因后對馬鈴薯抗晚疫病水平的影響

為了探究StBAG3基因在馬鈴薯抵抗晚疫病菌侵染過程中的作用,以瞬時表達(dá)空載體后接種晚疫菌的葉片部位作為對照,測定了在瞬時表達(dá)StBAG3基因的馬鈴薯離體葉片上接種晚疫病菌后不同時間點(diǎn)病斑的大小,結(jié)果表明(圖2),接種48 h后,當(dāng)對照的葉片部位開始出現(xiàn)水漬狀的病斑,而瞬時表達(dá)StBAG3基因的部位卻基本未見病斑的出現(xiàn)；接種72 h后對照葉片部位病斑面積明顯擴(kuò)大,但是表達(dá)StBAG3基因部位病斑面積只有小幅度增加。直到接種96 h后,當(dāng)對照葉片從接種部位開始腐爛時,表達(dá)StBAG3基因部位病斑面積依然較小。相對病斑面積計(jì)算的結(jié)果表明,在不同的接種時間點(diǎn)瞬時表達(dá)StBAG3基因后的葉片的相對病斑面積分別為0(0 h),0.58%(24 h),2.78%(48 h),3.90%(72 h),6.21%(96 h)；而對照相應(yīng)接種時間點(diǎn)的相對病斑面積分別為0(0 h),2.50%(24 h),11.58%(48 h),28.29%(72 h),45.36%(96 h)。24，48，72，96 h后接種位置病斑的相對面積較對照病斑顯著減少了1.92～39.15 百分點(diǎn)。顯而易見,瞬時表達(dá)StBAG3基因后葉片上病斑相對面積均顯著低于對照,預(yù)示著超表達(dá)StBAG3基因后能夠提高馬鈴薯對晚疫病的抗性水平。

馬鈴薯離體葉片左側(cè)接種水;右側(cè)接種晚疫菌。圖3-4同。Potato leaves were inoculated with water on the left and P.infestans on the right. The same as Fig.3-4.

由于臺盼藍(lán)染色可以用來定性研究壞死細(xì)胞的數(shù)量,因此,可以利用接種部位染色面積的大小和顏色定性比較病斑的大小。由圖3可知,在接種24 h后,瞬時表達(dá)StBAG3基因部位的死亡細(xì)胞數(shù)量與瞬時表達(dá)空載體的對照沒有明顯的差異,然而在接種48 h后,對照部位藍(lán)色的面積以及深度都要大于瞬時表達(dá)StBAG3部位,預(yù)示著瞬時表達(dá)目的基因部位壞死細(xì)胞數(shù)量少于對照部位。這種差異隨著接種時間的推移更加明顯。由此可知,瞬時表達(dá)StBAG3基因后葉片死亡細(xì)胞數(shù)量少是直接導(dǎo)致接種部位病斑變小的主要原因。

圖3 瞬時表達(dá)StBAG3葉片接種晚疫菌后死亡細(xì)胞數(shù)量的檢測(臺盼藍(lán)染色)Fig.3 The number of dead cells detection of leaves inoculated with P.infestansafter transient expression of StBAG3(Trypan blue staining)

2.2 瞬時表達(dá)StBAG3基因后對馬鈴薯離體葉片中H2O2產(chǎn)生的影響

過氧化氫的大量積累往往被認(rèn)為是標(biāo)定植物抗病水平的一個重要指標(biāo),因此,過氧化氫濃度的定量測定能夠客觀的反映接種部位的抗性水平。為了明確瞬時表達(dá)StBAG3基因后導(dǎo)致的病斑變化原因是否為過氧化氫積累水平,對瞬時表達(dá)目的基因和空載體后馬鈴薯離體葉片進(jìn)行晚疫病菌接種,對接種后不同時間點(diǎn)的葉片中過氧化氫的水平進(jìn)行測定。結(jié)果表明(圖4),在接種48 h之前,瞬時表達(dá)目的基因和對照部位的過氧化氫都表現(xiàn)出相同的小幅度上升趨勢,但二者沒有顯著差異；接種48 h后,瞬時表達(dá)StBAG3基因部位的過氧化氫積累的水平急劇增加,接種72 h后達(dá)到一個高峰值,為0.146 μmol/g,而此時間點(diǎn)對照葉片中的過氧化氫含量僅為0.086 μmol/g,盡管對照樣本相比前面的接種時間點(diǎn)仍然有上升的趨勢,但是增加幅度較?。粡慕臃N72 h后開始,瞬時表達(dá)StBAG3基因部位的過氧化氫的積累量從第一個峰值開始下降到0.120 μmol/g,而對照相應(yīng)的也從最高點(diǎn)降低到0.071 μmol/g,在這一時間點(diǎn),二者在過氧化氫積累水平上仍然表現(xiàn)出顯著的差異。在相同的試驗(yàn)設(shè)計(jì)下利用DAB染色定性測定的結(jié)果和定量測定結(jié)果基本一致,即在接種72 h后,過氧化氫在瞬時表達(dá)目的基因的部位顏色和面積明顯高于對照部位,且這種差異到接種96 h后雖然有所緩解,但是仍然存在一定的差異。上述的結(jié)果表明過氧化氫參與了StBAG3介導(dǎo)的馬鈴薯對晚疫病的抗性過程。

圖4 瞬時表達(dá)StBAG3基因后定量和定性檢測接種部位H2O2的積累量Fig.4 Quantitative and qualitative detection of accumulation of H2O2 in inoculation areas after transient expression of StBAG3

2.3 瞬時表達(dá)StBAG3基因后對ROS清除酶活性的影響

為了進(jìn)一步確定瞬時表達(dá)StBAG3基因后能夠誘導(dǎo)H2O2的積累,對瞬時表達(dá)目的基因和對照的離體馬鈴薯葉片接種不同的時間點(diǎn)后的ROS清除酶活性進(jìn)行了測定。結(jié)果表明(圖5)，不同的ROS清除酶活性在接種后不同時間點(diǎn)的變化趨勢明顯的不同。人工接種后,CAT酶的活性在瞬時表達(dá)目的基因的葉片中以及對照葉片中均呈現(xiàn)“先降低后升高再降低又升高”的變化模式,并分別在接種后48,96 h形成2個峰值,分別為0.061,0.041 U/(g·min)和0.074,0.040 U/(g·h)；瞬時表達(dá)目的基因葉片中CAT活性均高于對照葉片,其中接種后48～96 h二者差異顯著。SOD活性在接種后的瞬時表達(dá)目的基因葉片中呈現(xiàn)出“先降低后升高再降低”的變化模式,在接種72 h時出現(xiàn)1個高峰值,而在對照葉片中接種后的各時間點(diǎn)卻無顯著變化,除接種后24 h外,其他時間點(diǎn)瞬時表達(dá)目的基因葉片SOD活性均顯著高于對照葉片；POD酶活性在瞬時表達(dá)目的基因葉片以及對照葉片中均呈現(xiàn)上升的態(tài)勢,且二者之間在除96 h外的其他時間點(diǎn)均無顯著差異,在接種96 h后,瞬時表達(dá)目的基因葉片中POD酶活性顯著高于對照葉片。

圖5 瞬時表達(dá)StBAG3基因后接種葉片ROS清除酶活性的變化Fig.5 Variation of ROS scavenging enzymes activity of leaves after transient expression of StBAG3 and inoculated with P.infestans

3 結(jié)論與討論

研究表明,當(dāng)植物遇到外界刺激時,比如病原菌侵染,植物往往會有一系列的應(yīng)激反應(yīng),從而提高植物自身的抵抗能力,HR反應(yīng)就是植物抵抗病原的一個最為強(qiáng)烈且典型的抗性反應(yīng)。而過氧化氫是誘發(fā)HR反應(yīng)最重要的因素[10]。本研究以本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)克隆得到的馬鈴薯中的Bcl-2結(jié)合抗凋亡基因StBAG3為研究對象,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)體系,研究了StBAG3基因在馬鈴薯抗性建立過程中可能具有的功能,并初步探究了過氧化氫在StBAG3基因介導(dǎo)馬鈴薯抗性建立過程中的作用,旨在為馬鈴薯的抗病育種提供新的思路。初步的研究結(jié)果表明,StBAG3基因能夠提高馬鈴薯對晚疫病的抗性水平。在You等[30]對水稻中的OsBAG4基因的研究結(jié)果表明,由于OsBAG4過量積累,導(dǎo)致誘發(fā)先天性免疫表型和自發(fā)的細(xì)胞死亡、活性氧積累現(xiàn)象,從而使得水稻產(chǎn)生先天性免疫和廣譜抗病性；Kabbage等[31]發(fā)現(xiàn)擬南芥中的AtBAG6可以通過被蛋白酶水解從而被激活,進(jìn)而誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對病原菌的抗病性。上述的研究結(jié)果和本研究結(jié)果相似。

此外,定性和定量檢測的結(jié)果表明過氧化氫在StBAG3基因介導(dǎo)的馬鈴薯抗性建立過程中也發(fā)揮非常重要的作用。Patykowski等[32]發(fā)現(xiàn)2個抗病性不同的番茄品種在受到灰霉病菌(Botrytiscinerea)侵染后均能檢測到H2O2含量升高,并且抗病品種較感病品種出現(xiàn)的早,生成量更高,說明H2O2與植物抗病性緊密相關(guān),在受到病原菌侵染時參與了植物體自身的防御反應(yīng)。林志強(qiáng)等[33]研究發(fā)現(xiàn),外源施加H2O2能減緩葡萄霜霉病菌(Plasmoparaviticola)侵染過程,降低發(fā)病率和病情指數(shù)。黃貝梅[34]的研究表明,溫室條件下,抗病和感病的沙打旺植株在接種埃里磚格孢菌(Embellisiaastragali)后,H2O2含量均高于未被侵染的植株,而未被侵染的植株H2O2含量相對穩(wěn)定。施加外源H2O2后,感病沙打旺的病情指數(shù)和發(fā)病率均顯著低于對照,并且有效提高了POD、CAT、SOD等酶對抗病過程的調(diào)節(jié)作用,從而強(qiáng)化了寄主的病害防御體系,增加了對埃里磚格孢菌的抗性。以上研究結(jié)果與本試驗(yàn)的研究一致,均表明了H2O2參與了植物的抗性過程的建立。據(jù)已有研究表明,HR反應(yīng)通過細(xì)胞程序性死亡實(shí)現(xiàn),該反應(yīng)發(fā)生時,胼胝質(zhì)含量增高[35-36]。而過表達(dá)AtBAG6的植株細(xì)胞中的胼胝質(zhì)含量也顯著增加,這說明AtBAG6參與植物對生物脅迫的應(yīng)答可能是通過調(diào)節(jié)HR反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。而活性氧能夠誘導(dǎo)MAPK激酶,使HR反應(yīng)中的細(xì)胞程序性死亡發(fā)生[37-38]。所以,在本試驗(yàn)中H2O2含量的增加可能是因?yàn)镾tBAG3的過表達(dá)誘導(dǎo)了接種晚疫菌的葉片的HR反應(yīng)。另一方面,ROS易對細(xì)胞造成毒害,此時需要ROS清除機(jī)制來降低ROS的毒害[39-40],本試驗(yàn)中ROS清除酶活性出現(xiàn)不同程度的升高,可能因?yàn)镠2O2含量的增加。

本研究利用瞬時表達(dá)體系得到了有關(guān)StBAG3基因調(diào)控馬鈴薯抗性的一些初步結(jié)果,但是由于瞬時表達(dá)體系相比穩(wěn)定表達(dá)StBAG3株系具有一些缺點(diǎn),如該方法技術(shù)條件要求高并且得到的蛋白質(zhì)產(chǎn)物保存的時間較短,這些缺點(diǎn)將會限制研究者對StBAG3基因的調(diào)控模式、調(diào)控信號網(wǎng)絡(luò)等進(jìn)行深入細(xì)致的研究。因此,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得穩(wěn)定表達(dá)上述目的基因的轉(zhuǎn)基因株系,以及利用RNAi或VIGS體系對內(nèi)源的目的基因進(jìn)行沉默是研究上述基因在馬鈴薯抗病乃至抗逆過程中調(diào)控功能的當(dāng)務(wù)之急。