丁 偉，高文逸，程 茁，戴航宇

(1.東北農業(yè)大學農學院，哈爾濱 150030；2.東北農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱 150030）

水稻是中國重要糧食作物。20世紀80年代，黑龍江省開始大面積推廣水稻旱育稀植技術，水稻單產水平不斷提高[1]。目前化學壯秧劑在水稻育秧過程中大量應用，化學壯秧劑由調酸劑、無機肥料和化學殺菌劑復配而成，調酸劑大多為工業(yè)濃硫酸，不僅生產過程具有危險性，且應用過程也對水田生態(tài)環(huán)境造成嚴重污染[2]。生物藥肥是將有益功能微生物與作物所需養(yǎng)分結合，在生產上可防治有害生物，滿足作物生長發(fā)育養(yǎng)分需求。國內外該領域相關研究處于起步階段，目前國內尚無生物藥肥國家或行業(yè)標準。因此，研發(fā)環(huán)境友好的生物藥肥替代化學壯秧劑成為該領域研究熱點。

農業(yè)生產中，利用植物免疫作用減少化學農藥施用量，對解決環(huán)境污染問題具有重要意義。自從《Nature》報道植物本身存在有效免疫系統(tǒng)后[3]，國內外免疫相關研究迅速發(fā)展，使誘導植物抗病性進入實用化階段。傳統(tǒng)農藥僅針對特定病害，忽視植物對病原菌抵抗能力?？衫猛庠粗参锩庖呶镔|激發(fā)植物免疫系統(tǒng)，誘導植物產生廣譜抗病、抗逆能力，調節(jié)植物體內代謝系統(tǒng)、促進植物生長。外源植物免疫物質一般分為兩類：一是植物免疫誘導子，包括：蛋白、寡糖、生物代謝產物或有機活性小分子；二是植物免疫誘導菌，包括：木霉菌、芽孢桿菌等[4]。植物免疫誘導菌指菌體或其代謝產物可激發(fā)植物免疫系統(tǒng)，使植物獲得抗病及抗逆性能的微生物。利用植物免疫誘導菌生長過程中產生的多種活性物質抑制病原菌生長，刺激植株產生抗病因子，誘導植物產生免疫反應，可防治多種植物病害[5-6]。

為解決水稻旱育苗過程中立枯病這一難點問題，本文將枯草芽孢桿菌、哈茨木霉和青霉與礦質營養(yǎng)復配成生物藥肥并用于苗床育秧，測定水稻生長、土壤養(yǎng)分變化及秧苗抗逆酶活性，為利用生物藥肥誘導水稻秧苗免疫抗病替代化學農藥提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

供試哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、青霉（Penicillium）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）由東北農業(yè)大學農學院農藥學科保存并提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：葡萄糖12 g，瓊脂10 g，馬鈴薯120 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，充分溶解后121℃滅菌30 min。

NA培養(yǎng)基：蛋白胨6 g，牛肉膏5 g，NaCl 4 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調整pH 7.2，充分溶解后121℃高溫滅菌30 min。

無機磷真菌液體培養(yǎng)基：NaCl 0.3 g，KCl 0.4 g，(NH4)2SO40.4 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，FeSO4·7H2O 0.02 g，MnSO4·H2O 0.02 g，Ca3(PO4)24.0g，葡萄糖10 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0，121℃高溫滅菌30 min。

無機鉀真菌液體培養(yǎng)基：FeCl30.004 g,Na2HPO40.25 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，CaCO30.1 g，鉀長石粉5 g，葡萄糖5 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調整pH 7.0，充分溶解后121℃高溫滅菌30 min。

無機磷細菌液體培養(yǎng)基：NaCl 0.2 g，CaCO32.3 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，MnSO4·H2O 0.03 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，Ca3(PO4)210 g，葡萄糖3 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調整pH 7.0，充分溶解后于121℃高溫滅菌30 min。

無機鉀細菌液體培養(yǎng)基：Na2HPO41.6 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，(NH4)2SO40.4 g，鉀長石粉 5 g，（瓊脂20 g），蔗糖5 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調整pH 7.0，充分溶解后121℃高溫滅菌30 min。

1.2 室內試驗

1.2.1 供試菌株純化培養(yǎng)

取4℃冰箱內保存供試菌3株，分別放置于PDA和NA平板中央，倒置培養(yǎng)4～5 d，挑取供試菌株置于PDA和NA平板上進一步純化培養(yǎng)。

1.2.2 液體培養(yǎng)條件下解磷和解鉀能力測定

取供試3個菌株培養(yǎng)液10 mL用4層紗布過濾，轉移至離心管離心10 min，棄掉上清液加蒸餾水10 mL充分溶解后再次離心，棄掉上清液后將沉淀放入50 mL無菌水中，振蕩20 min使孢子散開。取充分散開孢子懸浮液滴入血球計數板后顯微鏡下計數，調整濃度直到獲得濃度為108cfu·mL-1孢子懸浮液。將制備孢子懸浮液按5%接種量接種于裝有200 mL難溶鉀礦石粉和難溶磷礦石粉液體培養(yǎng)基中，160 r·min-1振蕩培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)0、2、4、6和8 d時取樣品20 mL，離心后取上清液測定樣品中可溶性鉀和磷含量。

1.3 田間試驗

試驗于2017～2018年在東北農業(yè)大學校內園藝實驗站內完成，供試水稻品種為龍粳47號。4月10～15日播種，共設6個處理，見表1。水稻旱育苗小區(qū)面積為8 m2，4次重復。種子催芽后播種，采用機插盤旱育秧，育秧盤規(guī)格為：30 cm×60 cm，育秧土過篩后，按設計用量分別把供試菌株與N、P、K養(yǎng)分復配，與過篩育秧土混拌均勻，每盤裝混拌育秧土1.5 kg并澆透底水，每盤播催芽種子50 g，再用育秧土1 kg均勻覆蓋育秧盤表面。

表1 試驗處理及生物藥肥中菌液用量Table 1 Test treatment andbacterial fluid dosage in bio-fertilizer

1.3.1 秧苗素質測定和立枯病調查

水稻秧苗4葉期取樣，每處理取100株完整秧苗，清水洗凈根系，吸水紙吸干水分，測定幼苗莖基部寬度、株高、百株秧苗地上和根系鮮重及干重。采用游標卡尺測定莖基部寬度，采用烘干法測定干重，先在105℃下殺青30 min，調整溫度為60℃烘干至恒重。

水稻2葉期后是立枯病發(fā)病高峰期期。在水稻3葉期，調查試驗地立枯病，采用對角線5點取樣法，每點調查100株，立枯病發(fā)病率計算公式如下。

1.3.2 苗床土壤抗逆酶活性測定

在水稻2葉和4葉期取樣調查，取水稻幼苗完全展開葉片，分別測定SOD、POD酶活性，Pro、MDA含量，分別參照比色法[7]，愈創(chuàng)木酚比色法[8]，硫代巴比妥酸比色法和磺基水楊酸法[7]。

1.3.3 土壤養(yǎng)分測定

在播種前、水稻2葉和4葉期取苗床育秧土風干并過篩，測定土壤中堿解氮、速效磷和速效鉀含量，測定方法分別采用堿解擴散法[9]、鉬藍比色法和火焰光度計法。

1.4 數據處理與分析

試驗原始數據采用Excel 2013軟件整理，應用DPS 9.01統(tǒng)計軟件分析數據5%水平差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 菌株解磷和解鉀作用

青霉解磷能力隨時間延續(xù)而增強，上清液中可溶性磷含量在4 d時達最大值，377 μg·mL-1。哈茨木霉在培養(yǎng)6 d時可溶性磷含量達峰值，166.10 μg·mL-1，此后上清液中被供試菌株分解釋放的可溶性磷含量降低?？莶菅挎邨U菌具有一定解磷能力，但顯著低于青霉和哈茨木霉。

3個菌株培養(yǎng)基中可溶性鉀含量隨時間推移均逐漸增加。第10天，枯草芽孢桿菌、哈茨木霉和青霉菌液中可溶性鉀含量達到最大值，分別為58.43、39.20和38.06 μg·L-1，解鉀能力表現為：枯草芽孢桿菌＞木霉=青霉（見表2）。

表2 菌株解磷和解鉀效果Table 2 Effects of bacterial strain on phosphorus and potassium release

2.2 生物藥肥對水稻苗床土壤養(yǎng)分的影響

測定周期內堿解氮和速效鉀含量呈下降規(guī)律，速效磷含量呈先增后降趨勢。水稻2葉和4葉期，木霉+青霉+枯草芽孢桿菌處理堿解氮含量與對照相比提高12.5%，除青霉處理外，均顯著高于其他處理。2葉期，生物藥肥各處理速效磷含量比對照提高39.7%～118.9%。4葉期，速效磷含量開始降低，但木霉+青霉+枯草芽孢桿菌復配處理速效磷含量仍高于對照53.4%。2葉期，生物藥肥各處理與對照相比速效鉀含量提高15%～40.9%，4葉期，以木霉+青霉+枯草芽孢桿菌處理速效鉀含量最高（見表3）。生物藥肥顯著提高土壤堿解氮、速效磷和速效鉀含量，以木霉+青霉+枯草芽孢桿菌復配的生物藥肥效果最優(yōu)（見表3）。

表3 生物藥肥對水稻苗床土壤養(yǎng)分的影響Table 3 Effects of bio-fertilizer on soil nutrients in rice seedling culture bed

2.3 生物藥肥對水稻秧苗素質的影響

生物藥肥顯著增加水稻秧苗莖基部寬度，以木霉+青霉+枯草芽孢桿菌復合菌復配生物藥肥施用后水稻秧苗莖基部寬度最大，較對照增加11.5%。生物藥肥各處理株高與對照間差異不顯著。生物藥肥各處理均顯著增加水稻幼苗地上和根系鮮重和干重，以木霉+青霉+枯草芽孢桿菌復合菌復配生物藥肥顯著高于單一菌株復配生物藥肥（見表4）。

2.4 生物藥肥對水稻秧苗抗逆酶的影響

生物藥肥顯著提高SOD和POD活性及Pro含量，降低MDA含量。但施用單一菌株復配生物藥肥后，在水稻秧苗2葉和4葉期，SOD和POD活性，Pro含量均顯著低于復合菌株復配生物藥肥處理，MDA含量則顯著升高。其中木霉+青霉+枯草芽孢桿菌復合菌復配生物藥肥處理效果最優(yōu)（見表5）。

2.5 生物藥肥對立枯病發(fā)病率的影響

2017年生物藥肥各處理立枯病發(fā)病率均顯著低于對照，但復合菌株復配生物藥肥立枯病發(fā)病率顯著低于單一菌株復配生物藥肥處理，其中枯草芽孢桿菌+哈茨木霉和木霉+青霉+枯草芽孢桿菌復合菌株復配生物藥肥效果最好，無立枯病發(fā)生。2018年立枯病嚴重，各生物藥肥處理立枯病發(fā)病率均顯著低于對照，復合菌株復配生物藥肥立枯病發(fā)病率最低，對立枯病防治效果顯著，其中木霉+青霉+枯草芽孢桿菌復合菌復配生物藥肥處理效果最優(yōu)，立枯病發(fā)病率僅為2%（見表6）。

表4 生物藥肥對水稻秧苗素質的影響Table 4 Effects of bio-fertilizer on the quality of rice seedlings

表5 生物藥肥對水稻秧苗抗逆酶的影響Table 5 Effects of bio-fertilizer on stress resistance enzyme in rice seedlings

表6 生物藥肥對立枯病的影響Table 6 Effects of bio-fertilizer on the rice seedling blight

3討 論

生物藥肥優(yōu)勢在于集合多種植物免疫誘抗菌并與礦質養(yǎng)分復配，既保證水稻苗期所需營養(yǎng)，又發(fā)揮植物免疫誘抗菌抗病機制，更大限度發(fā)揮促生作用并提高抗病性，為水稻高產奠定良好基礎。相關研究發(fā)現，枯草芽孢桿菌、哈茨木霉和青霉產生多種活性物質，對多種病原菌具有抑制作用[5-6]?？莶菅挎邨U菌可產生細菌素、酶類、活性蛋白類和多肽類等物質，主要防治對象為絲狀真菌引起的植物病害，如水稻紋枯?。⊿tagonospo?ra curtisii）、番茄葉霉?。–ladosporium fulvum）、大豆根腐?。‵usarium graminerarum）、棉花立枯病(Rhizoctonia solani）。哈茨木霉在代謝過程中可產生多種抑制病原菌的活性物質，如抗菌肽、吡喃酮類抗生素等[10]。青霉菌活性次生代謝產物主要有青霉素類抗生素、生物堿類、蒽醌類和菌素類等[11-12]，均具有抑制病原菌作用。枯草芽孢桿菌、哈茨木霉和青霉不僅抑制植物病原菌，還釋放誘發(fā)植物局部和系統(tǒng)防御反應的化合物，誘導植物增強抗病性。枯草芽孢桿菌FZB24既產生與植物抗性蛋白合成基因表達相關的信號蛋白誘導植物抗性，也分泌相關蛋白如絲氨酸專性肽鏈內切酶直接誘導植物抗性[13]。哈茨木霉產生多種具有誘導作用的活性物質，如萜類化合物、酚衍生物、抗毒素、類黃酮、糖苷配基等。接種哈茨木霉和尖孢鐮刀菌的黃瓜植株中CAD、PPO、G-POD、CA-POD和CGA-POD活性顯著提高[14]。青霉菌誘導植株產生系統(tǒng)性抗病性，促進植株體內病程相關蛋白基因表達。青霉滅活菌絲體及其代謝產物誘導煙草POD和PPO活性提高，對煙草黑脛病具有顯著誘導抗病作用[15]。本研究發(fā)現，施用枯草芽孢桿菌+哈茨木霉+青霉復合菌復配生物藥肥后，誘導水稻秧苗抗逆酶活性顯著高于單一菌株，這是利用復合菌株復配生物藥肥降低立枯病發(fā)病率的一個重要原因。

枯草芽孢桿菌、哈茨木霉和青霉可產生生長調節(jié)物質，促進植物幼苗和根系生長發(fā)育，增強植物抗病性，間接減少病害發(fā)生。用枯草芽孢桿菌FZB24(r)處理后黃瓜根系顯著提高，且FZB24(r)液體培養(yǎng)物中還存在植物生長素及類似代謝物如細胞分裂素、脫落酸、赤霉酸等，對多種植物具有促生作用[14]。研究發(fā)現哈茨木霉發(fā)酵液中存在奈乙酸、吲哚乙酸和赤霉素類活性物質，且經哈茨木霉發(fā)酵液處理后，顯著提高白菜、菠菜和辣椒鮮重及葉綠素含量，促進作物生長發(fā)育。本研究結果表明，施用生物藥肥后，提高水稻秧苗莖基部寬度、地上部和根系鮮重、干重，水稻秧苗生長健壯，可提高水稻秧苗抗病性。

水稻是以收獲籽粒為目標的農作物，苗期生長情況直接影響后期生長。水稻苗期僅靠土壤中養(yǎng)分供給無法滿足苗期生長發(fā)育[16]。水稻播種前施足氮、磷、鉀養(yǎng)分，對促進根系發(fā)育，保障秧苗正常生長和增強抗病性發(fā)揮作用[17-18]。相關研究發(fā)現，枯草芽孢桿菌、哈茨木霉和青霉可通過產生有機酸、酶類或是莢膜多糖等，溶解土壤中難溶性養(yǎng)分，提高土壤有機質、速效磷、速效鉀和堿解氮含量[19-20]。本文供試微生物可分解釋放難溶磷和鉀，在施用生物藥肥后，尤其是復合菌株復配生物藥肥顯著提高土壤堿解氮、速效磷和速效鉀含量，通過促進土壤養(yǎng)分釋放，使水稻秧苗健壯生長，進而增強秧苗對立枯病抗病能力。

4結論

生物藥肥顯著提高土壤中堿解氮、速效磷和速效鉀含量，明顯增加水稻秧苗莖基部寬度、地上部和根系鮮重、干重，使水稻秧苗SOD、POD活性和Pro含量顯著增加，MDA含量顯著降低，水稻秧苗立枯病發(fā)病率顯著降低，且以木霉+青霉+枯草芽孢桿菌復合菌復配的生物藥肥效果最佳。