馬興紅，張其法，姜 南，李世杰，王一妹

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

在體靶向基因功能研究是生命科學(xué)領(lǐng)域新策略，其中病毒載體作為安全、有效基因治療工具受到關(guān)注。主流病毒載體包括：腺病毒（Adenovi?rus）、慢病毒（Lentivirus）、腺相關(guān)病毒（AAV，Ad?enovirus associated virus）[1]。腺相關(guān)病毒相比其他病毒具有免疫原性低、病毒顆粒小、滴度高、血清型多、安全性高、表達(dá)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，是最具潛力基因轉(zhuǎn)導(dǎo)工具[2]。rAAV載體在各類(lèi)疾病研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[3]。2013年，歐洲藥品管理局（EMA）批準(zhǔn)首個(gè)腺相關(guān)病毒基因藥物用于治療遺傳性代謝疾病[4]。子宮作為哺乳動(dòng)物雌性生殖器官重要組成，是胚胎著床和胎兒發(fā)育重要場(chǎng)所，研究不同發(fā)育階段子宮基因功能具有重要意義[5]。探尋在體靶向子宮特定基因研究有效途徑尤為必要。

決定AAV介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移效率關(guān)鍵因素為病毒載體對(duì)靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染程度，其中注射方式為組織細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率決定因素，主要包括靜脈注射、腹腔注射及定點(diǎn)注射等[6-7]。靜脈注射和腹腔注射操作簡(jiǎn)單、組織損傷較??；AAV具有器官靶向性，但也分布于非靶器官，因此非靶器官基因改變可能影響基因在特定組織或細(xì)胞類(lèi)型功能。同時(shí)AAV血清型較多，篩選特異性侵染靶器官血清型工作量大。BALB/c小鼠尾靜脈注射血清型1、5、6、8AAV發(fā)現(xiàn)，AAV1和AAV8在卵巢子宮中轉(zhuǎn)染效率高，AAV5在卵巢中無(wú)分布[8]。以AAV8為載體治療大鼠純合性家族高膽固醇血癥時(shí)發(fā)現(xiàn)，AAV8在雌性雄性性腺中均有表達(dá)，但分布較少[9]，表明靜脈注射存在不確定性。定點(diǎn)注射可在預(yù)定時(shí)間和生理狀態(tài)下在組織細(xì)胞中條件性表達(dá)基因，增加載體在靶器官分布量，提高轉(zhuǎn)染效率，但操作技術(shù)難度高，損傷組織。

借鑒腺病毒子宮角注射小鼠子宮研究經(jīng)驗(yàn)，腺病毒在子宮內(nèi)特異性感染腔上皮組織，但上皮基底膜作為屏障阻止病毒顆粒侵染基質(zhì)細(xì)胞[10]。研究發(fā)現(xiàn)子宮上皮特異性表達(dá)基因Plekhs1與子宮接受態(tài)轉(zhuǎn)變密切相關(guān)，當(dāng)子宮處于中性狀態(tài)時(shí)Plekhs1高表達(dá)，處于非接受態(tài)時(shí)Plekhs1不表達(dá)[11]。因此，本研究構(gòu)建包裝可沉默Plekhs1表達(dá)2型重組腺相關(guān)病毒（rAAV2-PL3），通過(guò)子宮角直接注射方法研究腺相關(guān)病毒在子宮組織中表達(dá)規(guī)律及干擾Plekhs1表達(dá)對(duì)小鼠生育能力影響，探索子宮細(xì)胞中條件性沉默特定基因可行性方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

8周齡性成熟昆明小鼠（體重18～22 g），購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。病毒載體質(zhì)粒AAV.U6.ShRLuc（AAV2）和輔助質(zhì)粒pAAV 2.9、pAdDeltaF6均由蘇州大學(xué)心血管病研究所胡士軍教授饋贈(zèng)。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物模型

①rAAV2-PL3在小鼠子宮表達(dá)規(guī)律試驗(yàn)：試驗(yàn)組，30只8周齡雌鼠隨機(jī)分為5組，通過(guò)手術(shù)于兩側(cè)子宮角注射20 μL rAAV2-PL3，分別在5 d、2、4、6、8周采集子宮組織；對(duì)照組6只成年雌鼠注射20 μL PBS（陰性對(duì)照）。

②rAAV2-PL3/SCR干擾Plekhs1表達(dá)及對(duì)生殖影響試驗(yàn)：24只8周齡雌鼠隨機(jī)分為2組，試驗(yàn)組通過(guò)手術(shù)從兩側(cè)子宮角注射20 μL rAAV2-PL3，對(duì)照組注射等體積rAAV2-SCR（空白對(duì)照）；病毒注射兩周后與昆明雄鼠合籠，隔夜發(fā)現(xiàn)栓塊后單獨(dú)飼養(yǎng)，見(jiàn)栓第4天每組隨機(jī)取6只小鼠，采集子宮組織；每組剩余6只小鼠，繼續(xù)飼養(yǎng)直至產(chǎn)仔，記錄小鼠產(chǎn)仔數(shù)。

1.2 方法

1.2.1 rAAV2載體構(gòu)建

在NCBI搜索小鼠Plekhs1基因轉(zhuǎn)錄本序列（NM_172641.3:80-1504）；通過(guò) thermofisher shR?NA設(shè)計(jì)網(wǎng)站設(shè)計(jì)5組Plekhs1 shRNA序列（見(jiàn)表1），送上海生工生物公司合成。MluⅠ、Bam HⅠ核酸內(nèi)切酶雙酶切AAV2質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳膠回收；合成shRNA片段退火；T4連接酶載體重新連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落送上海生工生物公司測(cè)序。

1.2.2 rAAV2制備

293T細(xì)胞接種150 mm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度80%，10 mL 10%FBS DMEM/F12培養(yǎng)基；12 h后開(kāi)始轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染體系：rAAV 12 μg、pAAV2.9 10 μg、pAdDeltaF6 6 μg、Opti培養(yǎng)基 600 μL、PEI（1 mg·mL-1）110 μL，6～8 h更換培養(yǎng)基；5%CO2、37℃，培養(yǎng)72 h后收集病毒（見(jiàn)圖1D）。添加培養(yǎng)基1/80體積 0.5 mol·L-1EDTA（pH 8.0）消化細(xì)胞，收集細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，4℃2 000 g 10 min；去除上清液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至同1支離心管中，4℃2 000 g 5 min，去上清液；2 mL HBSS緩沖液吹散細(xì)胞，渦旋震蕩2 min；液氮和37℃水浴鍋快速凍融3次，每循環(huán)約10 min；4℃，5 000～7 000 g，10 min；使用Millex-HV（0.45 μm）過(guò)濾上清；上清轉(zhuǎn)移至Amicon ultra-15（100 ku）濾器中，2 000 g，15℃，5 min，離心濃縮到合適體積（約200 μL）分裝，-80℃保存。

表1 Plekhs1基因shRNA序列Table 1 shRNA sequence of Plekhs1 genes

1.2.3 rAAV2子宮角注射

8周齡性成熟雌鼠，腹腔注射200 μL鹽酸賽拉嗪；麻醉后子宮角注射20 μL rAAV2-PL3，手術(shù)后連續(xù)1周腹腔注射10 000單位雙抗。

1.2.4 綠色熒光成像檢測(cè)

子宮冰凍切片（7 μm），55℃展片10～15 s；轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛（PFA），暗環(huán)境固定1 h；1×PBS清洗3次，每次5 min；DAPI染色10 s，1×PBS清洗2次，每次5 min；抗熒光猝滅劑封片，避光放置，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

石蠟組織切片烘箱（60℃）烘片；脫蠟進(jìn)水處理；檸檬酸鈉修復(fù)液中抗原修復(fù)，3%H2O2處理；濕盒內(nèi)10%馬血清封閉；10%馬血清稀釋一抗孵育（Plekhs1(P-15)，1∶100稀釋?zhuān)℅FP，1∶200稀釋?zhuān)?；二抗孵育（山羊抗兔IgG，1∶200），DAB顯色，蘇木精復(fù)染，稀鹽酸分色，氨水反藍(lán)；乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察。

1.2.6 小鼠子宮內(nèi)膜上皮原代細(xì)胞分離培養(yǎng)

發(fā)情期小鼠，取出子宮清洗干凈后翻轉(zhuǎn)子宮；子宮組織轉(zhuǎn)移至0.2%胰酶消化液中：4℃1 h，室溫60 min，37℃水浴30 min；終止消化，以105細(xì)胞密度接種至培養(yǎng)皿35 mm中；37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)20～30 min，未貼壁細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)皿（35 mm）中，去除基質(zhì)細(xì)胞。

1.2.7 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、Real-time PCR

TRIzol法提取總RNA，Nano Drop 2000c測(cè)RNA濃度；promega GoScript? Reverse Transcrip?tion Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄；real-time PCR使用TaKaRa試劑盒TB Green?Premix Ex Taq，Plekhs1引物序列：Forward Primer-GTTCAAGTGCCACCCA?GATG，Reverse Primer-TTCTCCTGTCATGGCCAAT；GAPDH引物序列：Forward Primer-GCCTTCCGT?GTTCCTACCC Reverse Primer-ACCTTTGGGCTTAC TCCA。PCR 在 Amplied Biosystems?7300 Real-Time PCR System儀器中反應(yīng)，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，以 2-ΔΔCT作數(shù)據(jù)分析。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析

GraphPad Prism 5.0軟件繪圖并分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用Mean±SEM表示，組間比較采用Student's t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 rAAV2載體構(gòu)建及病毒包裝

AAV2病毒基因組質(zhì)粒載體見(jiàn)圖1 A，合成shR?NA片段（見(jiàn)表1）插入Bam HⅠ、MluⅠ酶切位點(diǎn)之間，shRNA由U6啟動(dòng)子啟動(dòng)，載體上有外源插入EGFP組件。質(zhì)粒雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定獲得約5 000 bp條帶，參照陰性對(duì)照，酶切結(jié)果符合預(yù)期結(jié)果（見(jiàn)圖1B）；T4連接酶將酶切載體與退火合成shRNA片段重新連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落送上海生工生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)shRNA序列一致（見(jiàn)圖1C），重組載體構(gòu)建成功，載體重新命名為rAAV2-GFP-shRNA-Plekhs1；rAAV2-GFP-shRNA-scramble；重組病毒質(zhì)粒與兩個(gè)輔助質(zhì)粒通過(guò)PEI轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡觀察（見(jiàn)圖1 D），293T細(xì)胞狀態(tài)良好，EGFP在細(xì)胞中高表達(dá)，說(shuō)明病毒基因組質(zhì)粒在細(xì)胞中表達(dá)。

圖1 rAAV2載體構(gòu)建及病毒包裝Fig.1 rAAV2 vector construction and virus packaging

2.2 rAAV2侵染小鼠子宮上皮原代細(xì)胞

rAAV2侵染小鼠子宮內(nèi)膜上皮原代細(xì)胞，48 h后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞侵染率達(dá)100%（見(jiàn)圖2A、B），結(jié)果表明2型腺相關(guān)病毒可有效侵染小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞；Real-time PCR檢測(cè)各組rAAV2沉默Plekhs1基因表達(dá)效果，每組cDNA樣品3組平行樣，其中rAAV2-PL3沉默效果顯著（見(jiàn)圖2C），制備高濃度rAAV2-PL3用于在體注射試驗(yàn)。

圖2 rAAV2介導(dǎo)的Plekhs1 shRNA抑制Plekhs1基因表達(dá)Fig.2 Plekhs1-shRNA mediated by rAAV2 inhibits Plekhs1 gene expression

2.3 探究rAAV2-PL3注射小鼠子宮表達(dá)規(guī)律

小鼠子宮角注射rAAV2-PL3，不同時(shí)間點(diǎn)觀察病毒侵染效果，通過(guò)熒光檢測(cè)、EGFP基因免疫組化檢測(cè)（見(jiàn)圖3）發(fā)現(xiàn)隨侵染時(shí)間延長(zhǎng)，EGFP信號(hào)持續(xù)增強(qiáng)，信號(hào)主要在腔上皮和腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，陰性對(duì)照注射同體積PBS，子宮組織中無(wú)EGFP信號(hào)出現(xiàn)，子宮角注射病毒5 d即可檢測(cè)到EGFP信號(hào)，轉(zhuǎn)染6周信號(hào)最強(qiáng)，8周仍可檢測(cè)到較強(qiáng)表達(dá)信號(hào)。

2.4 rAAV2-PL3沉默Plekhs1基因表達(dá)

由圖4可知，通過(guò)免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，注射PBS陰性對(duì)照組見(jiàn)栓第4天小鼠子宮組織中EGFP不表達(dá)，Plekhs1在上皮細(xì)胞中表達(dá)（見(jiàn)圖4A、C）；注射rAAV2-PL3見(jiàn)栓第4天小鼠子宮中EGFP表達(dá)，Plekhs1不表達(dá)（見(jiàn)圖4B、D）；通過(guò)Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)注射rAAV2-PL3小鼠子宮比注射rAAV2-SCR小鼠Plekhs1表達(dá)明顯降低（見(jiàn)圖4E），表明Plekhs1被成功在體內(nèi)抑制。

2.5 注射rAAV2-PL3后產(chǎn)仔數(shù)統(tǒng)計(jì)

小鼠子宮角注射rAAV2-PL3 2周后，與正常雄鼠交配，隔天早上檢查陰道栓，見(jiàn)栓21 d后統(tǒng)計(jì)小鼠出生情況。由表2可知，注射rAAV2-PL3試驗(yàn)組小鼠產(chǎn)仔數(shù)分別為3、6、6、7、5只；注射rAAV2-SCR對(duì)照組小鼠產(chǎn)仔數(shù)分別為12、11、12、10、11只；可見(jiàn)試驗(yàn)組比對(duì)照組產(chǎn)仔數(shù)減少，說(shuō)明干擾Plekhs1對(duì)生殖有較大影響。F1代小鼠生育情況統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，注射rAAV2-PL3小鼠產(chǎn)仔數(shù)明顯減少（P＜0.05）（見(jiàn)圖5）。

圖3 rAAV2-PL3病毒侵染小鼠子宮EGFP表達(dá)規(guī)律Fig.3 Expression pattern of EGFP in mouse uterus infected by rAAV2-PL3 virus

圖4 rAAV2-PL3沉默子宮上皮Plekhs1表達(dá)Fig.4 rAAV2-PL3 silences uterine epithelial Plekhs1 expression

表2 子宮腔注射rAAV2-PL3/SCR病毒小鼠，F(xiàn)1代生育統(tǒng)計(jì)Table 2 Uterine cavity injection virus mice,fertility statistics of F1generation

圖5 F1代生育情況統(tǒng)計(jì)分析Fig.5 F1generation statistical analysis of fertility

3討 論

隨著基因工程技術(shù)快速發(fā)展，條件性基因敲除鼠成為研究某一基因在體內(nèi)功能重要方法，但制作條件性基因敲除鼠費(fèi)時(shí)費(fèi)力[12]。腺相關(guān)病毒作為最有潛力基因治療載體可在多種組織中穩(wěn)定表達(dá)外源基因，感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，在體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)且對(duì)人體無(wú)致病性，因此AAV為一種安全病毒載體[13]。腺相關(guān)病毒在子宮基因功能應(yīng)用目前尚無(wú)報(bào)道。

3.1 重組腺相關(guān)病毒制備及沉默Plekhs1效果篩選

RNAi特異性沉默基因表達(dá)，廣泛應(yīng)用于基因功能研究領(lǐng)域。將雙鏈小干擾RNA(siRNA)高效傳遞至體內(nèi)靶細(xì)胞是RNAi成功用于疾病治療的關(guān)鍵。腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)RNAi成功解決這一難題，同時(shí)有效解決RNAi轉(zhuǎn)染效率低、轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)間短、成本高等問(wèn)題[14]。Wakimoto等將AAV-shRNA應(yīng)用于小鼠心臟疾病研究[15]。Plekhs1為小鼠子宮上皮特異性表達(dá)基因，與子宮接受態(tài)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[11]。本研究針對(duì)Plekhs1 mRNA設(shè)計(jì)shRNA序列，成功構(gòu)建、包裝rAAV2病毒；侵染小鼠子宮內(nèi)膜上皮原代細(xì)胞，Real-time PCR篩選沉默效果最強(qiáng)rAAV2-PL3病毒。

3.2 檢測(cè)子宮角注射rAAV2-PL3表達(dá)規(guī)律

注射方式為腺相關(guān)病毒介導(dǎo)基因在靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率關(guān)鍵因素。心血管疾病研究發(fā)現(xiàn)，尾靜脈注射AAV9對(duì)心臟組織有較強(qiáng)感染能力，同時(shí)在腦組織、肺組織、肝臟組織也有較強(qiáng)感染能力，影響試驗(yàn)結(jié)果，王惠等通過(guò)心肌層注射方法增加病毒在心臟組織分布并長(zhǎng)期表達(dá)[16]。Chen等靜脈注射AAV在子宮表達(dá)量低，表達(dá)時(shí)間短，難以滿(mǎn)足試驗(yàn)需要[9]。本研究首先驗(yàn)證腺相關(guān)病毒rAAV2-PL3直接子宮角注射有利于條件性靶向轉(zhuǎn)染子宮細(xì)胞。通過(guò)熒光檢測(cè)、免疫組化技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染第5天在腔上皮檢測(cè)到EGFP信號(hào)，轉(zhuǎn)染6周時(shí)信號(hào)最佳，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間延長(zhǎng)EGFP信號(hào)不斷增強(qiáng)，累積效果明顯，信號(hào)顯示范圍擴(kuò)大。值得注意的是，病毒侵染信號(hào)主要集中在腔上皮和腺上皮細(xì)胞，上皮結(jié)構(gòu)完整，表明上皮基底膜細(xì)胞可作為屏障阻止病毒顆粒侵染基質(zhì)細(xì)胞[10]。

3.3 rAAV2-PL3沉默子宮上皮Plekhs1表達(dá)及對(duì)生育影響

馬珍子等研究發(fā)現(xiàn)正常妊娠過(guò)程中見(jiàn)栓第4天腔上皮細(xì)胞PLEKHS1高表達(dá)[11]，本研究通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)rAAV2-PL3感染小鼠見(jiàn)栓第4天子宮細(xì)胞Plekhs1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)小鼠子宮腔上皮細(xì)胞Plekhs1蛋白表達(dá)明顯減弱；通過(guò)Real-time PCR進(jìn)一步驗(yàn)證Plekhs1已被沉默。研究人員檢測(cè)AAV侵染后的生殖細(xì)胞及子代體內(nèi)病毒基因表達(dá)，研究腺相關(guān)病毒在生殖系統(tǒng)應(yīng)用是否存在安全問(wèn)題。Calcedo等發(fā)現(xiàn)在新生兒體內(nèi)即可檢測(cè)到AAV抗體，野生型AAV侵染人體是必然事件[17]；Couto等利用AAV2侵染小鼠成熟精子，人工受精后胚胎移植，在后代中未檢測(cè)到AAV2基因表達(dá)，表明AAV2無(wú)法整合于生殖細(xì)胞[18]。本研究子宮角注射對(duì)照病毒rAAV2-SCR，小鼠產(chǎn)仔數(shù)量未受影響，表明子宮角注射腺相關(guān)病毒方法對(duì)子宮功能無(wú)影響。為驗(yàn)證rAAV2-PL3沉默Plekhs1表達(dá)是否對(duì)小鼠生育能力造成影響，統(tǒng)計(jì)注射rAAV2-PL3與對(duì)照病毒rAAV2-SCR小鼠產(chǎn)仔數(shù)，分析發(fā)現(xiàn)注射rAAV2-PL3小鼠產(chǎn)仔量比對(duì)照組減少約50%。結(jié)果表明，沉默Plekhs1表達(dá)降低生育能力，Plekhs1在妊娠過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

綜上，腺相關(guān)病毒介導(dǎo)shRNA通過(guò)子宮角注射是實(shí)現(xiàn)子宮特定基因條件性干擾的可行方法，有助于研究妊娠過(guò)程子宮基因潛在功能。但因腺相關(guān)病毒無(wú)法突破阻礙進(jìn)入子宮基質(zhì)，研究子宮基質(zhì)細(xì)胞基因功能的方法需進(jìn)一步完善。