張 雯，王 琳，孫雅麗，馬建章

（東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱 150040）

奶牛乳腺炎主要是由于乳腺組織受物理或化學(xué)性損傷及微生物等刺激導(dǎo)致的局部性炎癥反應(yīng)，圍產(chǎn)期前后發(fā)病率較高[1]，嚴(yán)重危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)，造成經(jīng)濟(jì)損失，主要包括產(chǎn)奶量降低、乳品質(zhì)下降、棄乳，母牛發(fā)情延期、配種時(shí)間縮短甚至淘汰[2-3]。研究表明，患有乳房炎奶牛乳汁中金黃色葡萄球菌檢出率最高，其次是大腸桿菌和鏈球菌[4]。我國奶牛乳腺炎主要致病菌為大腸桿菌，其外膜含有較多脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），大腸桿菌進(jìn)入乳腺組織后釋放毒性物質(zhì)可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，LPS為主要致病毒力因子，也是引起大腸桿菌型乳腺炎的主因。

目前臨床上奶牛乳腺炎仍以抗生素治療為主，特別是急性乳腺炎，抗生素具有起效迅速且消炎效果明顯等特點(diǎn)[5]，但廉價(jià)抗生素濫用，造成抗藥性等問題日趨嚴(yán)重。因此，尋找替代抗生素新療法成為乳腺炎防治熱點(diǎn)[6]，中草藥作為新型治療奶牛乳腺炎方法前景廣闊，研究其對乳腺炎保護(hù)作用機(jī)制十分重要?？Х人崾且活愄烊环铀犷惢衔?，在各種水果、蔬菜及草藥中廣泛存在，可清除炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放的氧自由基，具有抗炎、抗氧化等多種生物學(xué)效應(yīng)[7]，推測咖啡酸對乳腺炎癥具有保護(hù)作用，但咖啡酸對乳腺炎保護(hù)作用的研究鮮有報(bào)道。為降低以奶牛為試驗(yàn)動(dòng)物的高昂成本，以誘導(dǎo)小鼠感染乳腺炎建模，研究該病發(fā)生機(jī)制應(yīng)用廣泛[8]，且LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺炎癥模型可有效復(fù)制腸桿菌感染乳腺炎反應(yīng)過程[9]。

因此，本試驗(yàn)通過LPS灌注乳腺導(dǎo)管方式建立小鼠乳腺炎模型，采用H.E.染色、ELISA檢測和Western blot檢測方法，分別比較各組病理組織學(xué)變化、炎性細(xì)胞因子水平和炎性信號通路蛋白檢測結(jié)果，研究咖啡酸對LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺炎保護(hù)作用及其機(jī)制，旨在為奶牛乳腺炎防治提供新藥物。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)所用鼠籠、喂水瓶及墊料等高壓滅菌并烘干，保證小鼠生存環(huán)境清潔衛(wèi)生。昆明小鼠，雌鼠36只，雄鼠12只，6～8周齡，體重18～22 g，購自哈爾濱試驗(yàn)動(dòng)物中心，其中12只雌鼠、4只雄鼠用于建立小鼠乳腺炎模型試驗(yàn)；24只雌鼠、8只雄鼠用于研究咖啡酸對小鼠乳腺炎癥保護(hù)作用。飼養(yǎng)室溫度20～25℃，相對濕度40%～70%，先將雌雄小鼠分別飼養(yǎng)48 h使其適應(yīng)環(huán)境，再按照雌雄3∶1同籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間飼喂市售鼠糧，保證足夠飲水及采食。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組

建立小鼠乳腺炎模型時(shí)，將12只雌鼠隨機(jī)分為對照組和LPS組，每組6只小鼠。研究咖啡酸對LPS刺激小鼠乳腺炎的保護(hù)作用時(shí)，將24只雌鼠隨機(jī)分為4組，即對照組、LPS組、LPS+CA（10 mg·kg-1BW）組和LPS+CA（20 mg·kg-1BW）組，每組6只小鼠；LPS+CA（10 mg·kg-1BW）組和LPS+CA（20 mg·kg-1BW）在灌注LPS后1 h腹腔注射咖啡酸，同時(shí)空白對照組和LPS組注射等量PBS。

1.3 試劑

LPS（大腸桿菌，血清型O55：B5）購自美國Sigma公司；小鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定（ELI?SA）試劑盒購自Biolegend公司；乙醇、二甲苯、蘇木精染液和伊紅染液等H.E.染色試劑均購自碧云天生物公司；咖啡酸（純度99%）購自中國食品藥品檢定研究院；BCA蛋白分析試劑盒購自北京全試金公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、Western及IP細(xì)胞裂解液、Tween-20、SDS和PBS溶液等Western blot所需試劑均購自碧云天生物公司；鼠源單克隆抗體NF-κBp65、NF-κBp-p65、I-κBα、p-I-κBα、p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK以及內(nèi)參抗體β-actin均購自Abcam公司（中國上海）。所有其他化學(xué)品均為試劑級。

1.4 試驗(yàn)儀器

分析天平購自德國Sartorius公司；旋渦混勻器購自江蘇新康醫(yī)療器械有限公司；紫外分光光度計(jì)購自賽默飛世爾科技；切片機(jī)購自德國萊卡公司；電熱烘干箱購自上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；高壓鍋購自上海博訊試業(yè)公司；-80℃超低溫冰箱購自上海頤鵬集成設(shè)備有限公司；超凈工作臺(tái)購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；高速低溫離心機(jī)購自Eppendorf生命科學(xué)公司；電子顯微鏡購自日本尼康公司；DYCZ-25D型蛋白垂直電泳槽、DYCZ-40D型濕式轉(zhuǎn)印電泳槽和WD-9405E型脫色搖床均購自北京六一生物科技有限公司；酶標(biāo)儀購自天津瑞澤分析儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購自北京百晶生物技術(shù)公司。

1.5 小鼠乳腺炎模型建立

將分娩7 d后12只孕鼠與仔鼠分籠，建模前3 h雌鼠禁食禁水，建模前1 h腹腔注射適量烏拉坦將小鼠麻醉。將小鼠仰臥固定在操作臺(tái)上，75%酒精棉球擦拭第4對乳腺及周圍區(qū)域皮膚，充分消毒且使其充分暴露，左手持無菌眼科鑷夾取乳頭并固定，右手用滅菌眼科剪剪除1 mm乳頭尖端，暴露乳頭導(dǎo)管。用微量注射器吸取0.2 mg·mL-1LPS 50 μL，沿乳頭導(dǎo)管緩慢灌注到乳腺內(nèi)，對照組灌注相同體積PBS。LPS刺激24 h后，斷頸法處死小鼠，75%酒精消毒腹部皮膚后，沿腹中線剪開腹部皮膚，暴露第4對乳腺并收集。取適量乳腺組織浸泡在4%多聚甲醛中固定，用于H.E.染色觀察乳腺組織病理學(xué)變化，其余組織-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 乳腺組織病理學(xué)檢測

依次固定-脫水-透明-石蠟包埋-切片-切片脫蠟-蘇木精染色-伊紅染色-乙醇-二甲苯-封片，制成H.E.切片，并將染色后乳腺組織切片置于顯微鏡下觀察乳腺組織病理學(xué)變化。

①固定：將取樣乳腺組織于4℃冰箱在4%多聚甲醛溶液中固定24 h。

②脫水：將固定組織塊用PBS緩沖液清洗3次，依次放入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ中各脫水1 h。

③透明：將脫水組織塊表面乙醇吸干后依次放入二甲苯A和二甲苯B中各15 min，直至組織呈透明狀。

④浸蠟：將組織塊依次放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ中各30 min。

⑤包埋：先將石蠟熔化倒入包埋模具內(nèi)，再用鑷子將浸蠟組織塊切面向下埋入熔蠟中，石蠟充分凝固變硬后取出，修整為規(guī)則長方形。

⑥切片：用切片機(jī)將包埋后石蠟切成厚度為5 μm切片，放在42℃溫水中展平并用載玻片附著，最后將切片放入60℃烘箱中過夜烘干備用。

⑦切片脫蠟：將組織切片依次放入二甲苯A和二甲苯B中各15 min，依次放入100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中各5 min，蒸餾水沖洗3次。

⑧染色：將組織切片浸入蘇木精染液中5 min，自來水中浸泡20 min返藍(lán)處理，伊紅染液中浸泡5 min。

⑨脫水、透明、封片：將組織切片依次放入80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ中各2 min脫水，經(jīng)二甲苯A和二甲苯B各處理5 min透明處理，用中性樹膠及蓋玻璃片封片。

⑩鏡檢：將染色后乳腺組織切片置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 乳腺組織中炎性細(xì)胞因子水平檢測

組織勻漿制備：將雌鼠右側(cè)乳腺組織和PBS按照1∶9（W/V，g·mL-1）加入玻璃組織勻漿器中勻漿，充分勻漿后轉(zhuǎn)移至離心管中4℃、2 000 g離心40 min，除去上層脂肪，將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中4℃、2 000 g離心20 min，棄去剩余脂肪，收集上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，測定乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平。

按照ELISA說明書，測定兩個(gè)不同處理組樣品450 nm處吸光值，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本TNF-α相應(yīng)濃度。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)樣本，每個(gè)樣本測定3個(gè)重復(fù)值。

1.8 蛋白質(zhì)印跡分析

根據(jù)制造商說明，使用Western及IP細(xì)胞裂解液提取凍存在-80℃冰箱中小鼠乳腺組織中蛋白質(zhì)，用BCA蛋白分析試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。依次配膠-加樣-電泳-轉(zhuǎn)膜封閉-一抗孵育-洗膜-二抗孵育-洗膜-顯影。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離裂解產(chǎn)物中蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用含0.05%Tween-20PBS緩沖鹽水（PBST），添加5%脫脂牛奶緩沖液及含5%牛血清白蛋白（BSA）緩沖液，分別在搖床上室溫下封閉非磷酸化和磷酸化特異性一抗，封閉時(shí)間均為1 h；PBST清洗；特異性一抗在一抗稀釋液中稀釋比例為1∶1000，與膜在4℃冰箱中孵育過夜；PBST清洗膜；與過氧化物酶偶聯(lián)二抗在室溫下孵育1 h；采用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒并使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)Image Quant檢測免疫活性蛋白。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均用means±S.E.M形式表示。利用方差和Student's t-test分析任意兩組數(shù)據(jù)間差異性。P＜0.05代表差異顯著。利用Image J軟件分析Western blot結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳腺組織病理變化

鏡下觀察咖啡酸對乳腺組織病理學(xué)變化的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示?？瞻讓φ战M小鼠乳腺組織學(xué)狀態(tài)見圖1A，乳腺腺泡結(jié)構(gòu)完整，腺泡腔中可見乳汁著色；LPS刺激組小鼠乳腺組織病理學(xué)變化見圖1B，乳腺腺泡壁明顯增厚、水腫，腺泡腔中充滿大量嗜中性粒細(xì)胞，且可見乳腺組織中明顯充血和淤血發(fā)生；LPS+CA低劑量組小鼠乳腺組織病理學(xué)變化見圖1C，乳腺腺泡壁變薄，且無水腫現(xiàn)象，充血情況明顯改善；LPS+CA高劑量組小鼠乳腺組織病理學(xué)變化見圖1D，乳腺組織恢復(fù)正常，結(jié)構(gòu)完整?？芍?，咖啡酸可改善LPS刺激小鼠乳腺組織損傷情況。

圖1 不同處理組小鼠乳腺病理組織學(xué)切片（400×）Fig.1 Histopathologic sections of different treatments of mice mammary gland（400×）

2.2 乳腺組織中炎性細(xì)胞因子檢測

利用ELISA檢測咖啡酸對小鼠乳腺組織中細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，與空白對照組相比，LPS刺激組與LPS+CA-L、LPS+CA-H組TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），而LPS+CA組3種細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平顯著低于LPS刺激組，且隨CA濃度升高而降低，呈明顯劑量依賴。說明咖啡酸抑制LPS刺激小鼠乳腺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)，進(jìn)一步證明咖啡酸對LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺炎有保護(hù)作用。

圖2 咖啡酸對乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6的影響Fig.2 Effects of caffeic acid on the production of inflammatory cytokine TNF-α,IL-1β and IL-6 in mammary gland

2.3 咖啡酸對小鼠乳腺組織NF-κB信號通路的影響

通過Western blot方法檢測IκB和p65蛋白的磷酸化水平，探究咖啡酸對NF-κB信號通路激活情況，結(jié)果如圖3所示。LPS刺激小鼠乳腺組織顯著激活I(lǐng)κB和p65蛋白磷酸化，咖啡酸則顯著降低LPS誘導(dǎo)p-p65和p-IκB蛋白水平，結(jié)果說明咖啡酸可顯著抑制LPS對NF-κB信號通路激活，進(jìn)一步抑制炎性介質(zhì)產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用。

圖3 咖啡酸對NF-κB信號通路的影響Fig.3 Effects of caffeic acid on the activation of NF-κB signal pathway

2.4 咖啡酸對小鼠乳腺組織MAPKs信號通路的影響

通過檢測p38、ERK和JNK蛋白磷酸化水平，探究咖啡酸對MAPKs信號通路影響，結(jié)果如圖4所示。LPS刺激小鼠乳腺組織顯著激活p38、ERK和JNK蛋白磷酸化，咖啡酸則顯著降低LPS誘導(dǎo)的pp38、p-JNK和p-ERK蛋白磷酸化水平，結(jié)果說明咖啡酸顯著抑制LPS對MAPKs信號通路的激活。

圖4 咖啡酸對MAPKs信號通路的影響Fig.4 Effects of caffeic acid on the activation of MAPKs signal pathway

3 討論與結(jié)論

病理學(xué)檢測結(jié)果顯示，LPS刺激小鼠乳腺組織可引發(fā)炎癥反應(yīng)，乳腺腺泡壁增厚、水腫，腺泡腔中充滿大量嗜中性粒細(xì)胞，乳腺組織明顯充血和淤血，與Hu等研究結(jié)果一致[10]。然而，低劑量（10 mg·kg-1BW）咖啡酸處理小鼠乳腺組織腺泡壁變薄，且無水腫現(xiàn)象，充血狀況改善；高劑量（20 mg·kg-1BW）咖啡酸處理小鼠乳腺組織恢復(fù)正常，結(jié)構(gòu)完整。結(jié)果說明咖啡酸可改善LPS刺激小鼠乳腺組織損傷情況。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，LPS灌注乳腺導(dǎo)管引起小鼠乳腺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平升高，與Alhussien等研究結(jié)果一致[11]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α是最先產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)IL-6、IL-8等細(xì)胞因子生成；激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞組織募集并促進(jìn)組織破壞[12]；刺激嗜中性粒細(xì)胞使其向炎癥部位聚集發(fā)揮作用，加劇炎癥反應(yīng)[13]。本試研究中咖啡酸抑制乳腺炎發(fā)生過程中TNF-α過量表達(dá)，緩解炎癥反應(yīng)，Zheng等研究表明下調(diào)TNF-α過度表達(dá)可改善TNF-α誘導(dǎo)病理過程，與本試驗(yàn)結(jié)果一致[14]。IL-6和IL-1β在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)方面也有重要作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6是LPS誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)燒的基本介質(zhì)[16]，對白細(xì)胞有趨化作用使其進(jìn)入感染部位，加劇炎癥反應(yīng)過程[17]；IL-1β是一個(gè)多功能高度炎性細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子并協(xié)同其他炎性細(xì)胞因子加劇炎癥反應(yīng)進(jìn)程[18-19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，咖啡酸可抑制LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺組織中IL-6和IL-1β過度表達(dá)，緩解炎癥反應(yīng)，牟瑞營等研究表明下調(diào)IL-6和IL-1β過度表達(dá)可改善小鼠乳腺炎癥，與本試驗(yàn)結(jié)果一致[20]。由此表明咖啡酸可能通過TNF-α、IL-6和IL-1β等炎性細(xì)胞因子過量產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)對LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎保護(hù)作用。

研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB和MAPKs在炎癥反應(yīng)過程中可介導(dǎo)多種炎性細(xì)胞因子活化與釋放，是LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中兩條經(jīng)典路徑[21]。靜息狀態(tài)下，NF-κBp65-p50二聚體蛋白與NF-κB抑制蛋白IκB聚合成p65-p50-IκB三聚體，存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)機(jī)體受到LPS刺激時(shí)，IκB發(fā)生磷酸化反應(yīng)并降解該三聚體，導(dǎo)致IκB與p65-p50蛋白分離，使NF-κBp65亞基暴露并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與目的基因結(jié)合啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致多種炎性細(xì)胞因子表達(dá)，誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)[22]。NF-κB參與IL-1β前體合成[23]。研究表明抑制NF-κB信號通路激活有利于抑制炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生[24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，咖啡酸抑制NF-κBp65和IκB蛋白磷酸化從而抑制NF-κB信號通路激活，減少炎性細(xì)胞因子表達(dá)，對LPS誘導(dǎo)乳腺炎具有一定保護(hù)作用。MAPKs信號通路參與調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子合成與釋放，MAPKs是絲裂原激活蛋白激酶家族，其中p38、JNK、ERK是MAPKs信號通路中重要途徑，當(dāng)機(jī)體受外界刺激時(shí)，使p38、JNK、ERK發(fā)生磷酸化反應(yīng)激活MAPKs信號通路，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)炎性細(xì)胞因子表達(dá)，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[25-26]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，咖啡酸通過抑制p38、JNK、ERK蛋白磷酸化，抑制MAPKs信號通路激活減少相關(guān)炎性細(xì)胞因子表達(dá)，達(dá)到對LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺的保護(hù)作用。闞興池研究證明通過抑制NF-κB和MAPKs信號通路激活可實(shí)現(xiàn)對乳腺的保護(hù)作用，與本試驗(yàn)結(jié)果一致[27]。此外，劉明江證實(shí)咖啡酸在細(xì)胞水平通過抑制NF-κB和MAPKs通路激活發(fā)揮抗炎作用[22]。

本文初步研究咖啡酸對LPS誘導(dǎo)乳腺炎的抗炎機(jī)制，結(jié)果表明咖啡酸通過降低NF-κBp65和MAPKs通路磷酸化水平發(fā)揮抗炎作用。是否存在其他信號通路與咖啡酸發(fā)揮抗炎作用尚待深入研究。