張 雯，王 琳，孫雅麗，馬建章

（東北林業(yè)大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱 150040）

奶牛乳腺炎主要是由于乳腺組織受物理或化學性損傷及微生物等刺激導致的局部性炎癥反應，圍產(chǎn)期前后發(fā)病率較高[1]，嚴重危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)，造成經(jīng)濟損失，主要包括產(chǎn)奶量降低、乳品質下降、棄乳，母牛發(fā)情延期、配種時間縮短甚至淘汰[2-3]。研究表明，患有乳房炎奶牛乳汁中金黃色葡萄球菌檢出率最高，其次是大腸桿菌和鏈球菌[4]。我國奶牛乳腺炎主要致病菌為大腸桿菌，其外膜含有較多脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），大腸桿菌進入乳腺組織后釋放毒性物質可誘導機體產(chǎn)生嚴重的炎癥反應，LPS為主要致病毒力因子，也是引起大腸桿菌型乳腺炎的主因。

目前臨床上奶牛乳腺炎仍以抗生素治療為主，特別是急性乳腺炎，抗生素具有起效迅速且消炎效果明顯等特點[5]，但廉價抗生素濫用，造成抗藥性等問題日趨嚴重。因此，尋找替代抗生素新療法成為乳腺炎防治熱點[6]，中草藥作為新型治療奶牛乳腺炎方法前景廣闊，研究其對乳腺炎保護作用機制十分重要。咖啡酸是一類天然酚酸類化合物，在各種水果、蔬菜及草藥中廣泛存在，可清除炎癥反應發(fā)生時中性粒細胞和巨噬細胞釋放的氧自由基，具有抗炎、抗氧化等多種生物學效應[7]，推測咖啡酸對乳腺炎癥具有保護作用，但咖啡酸對乳腺炎保護作用的研究鮮有報道。為降低以奶牛為試驗動物的高昂成本，以誘導小鼠感染乳腺炎建模，研究該病發(fā)生機制應用廣泛[8]，且LPS誘導小鼠乳腺炎癥模型可有效復制腸桿菌感染乳腺炎反應過程[9]。

因此，本試驗通過LPS灌注乳腺導管方式建立小鼠乳腺炎模型，采用H.E.染色、ELISA檢測和Western blot檢測方法，分別比較各組病理組織學變化、炎性細胞因子水平和炎性信號通路蛋白檢測結果，研究咖啡酸對LPS誘導小鼠乳腺炎保護作用及其機制，旨在為奶牛乳腺炎防治提供新藥物。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗所用鼠籠、喂水瓶及墊料等高壓滅菌并烘干，保證小鼠生存環(huán)境清潔衛(wèi)生。昆明小鼠，雌鼠36只，雄鼠12只，6～8周齡，體重18～22 g，購自哈爾濱試驗動物中心，其中12只雌鼠、4只雄鼠用于建立小鼠乳腺炎模型試驗；24只雌鼠、8只雄鼠用于研究咖啡酸對小鼠乳腺炎癥保護作用。飼養(yǎng)室溫度20～25℃，相對濕度40%～70%，先將雌雄小鼠分別飼養(yǎng)48 h使其適應環(huán)境，再按照雌雄3∶1同籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間飼喂市售鼠糧，保證足夠飲水及采食。

1.2 試驗動物分組

建立小鼠乳腺炎模型時，將12只雌鼠隨機分為對照組和LPS組，每組6只小鼠。研究咖啡酸對LPS刺激小鼠乳腺炎的保護作用時，將24只雌鼠隨機分為4組，即對照組、LPS組、LPS+CA（10 mg·kg-1BW）組和LPS+CA（20 mg·kg-1BW）組，每組6只小鼠；LPS+CA（10 mg·kg-1BW）組和LPS+CA（20 mg·kg-1BW）在灌注LPS后1 h腹腔注射咖啡酸，同時空白對照組和LPS組注射等量PBS。

1.3 試劑

LPS（大腸桿菌，血清型O55：B5）購自美國Sigma公司；小鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定（ELI?SA）試劑盒購自Biolegend公司；乙醇、二甲苯、蘇木精染液和伊紅染液等H.E.染色試劑均購自碧云天生物公司；咖啡酸（純度99%）購自中國食品藥品檢定研究院；BCA蛋白分析試劑盒購自北京全試金公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、Western及IP細胞裂解液、Tween-20、SDS和PBS溶液等Western blot所需試劑均購自碧云天生物公司；鼠源單克隆抗體NF-κBp65、NF-κBp-p65、I-κBα、p-I-κBα、p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK以及內參抗體β-actin均購自Abcam公司（中國上海）。所有其他化學品均為試劑級。

1.4 試驗儀器

分析天平購自德國Sartorius公司；旋渦混勻器購自江蘇新康醫(yī)療器械有限公司；紫外分光光度計購自賽默飛世爾科技；切片機購自德國萊卡公司；電熱烘干箱購自上海森信試驗儀器有限公司；高壓鍋購自上海博訊試業(yè)公司；-80℃超低溫冰箱購自上海頤鵬集成設備有限公司；超凈工作臺購自蘇州凈化設備有限公司；高速低溫離心機購自Eppendorf生命科學公司；電子顯微鏡購自日本尼康公司；DYCZ-25D型蛋白垂直電泳槽、DYCZ-40D型濕式轉印電泳槽和WD-9405E型脫色搖床均購自北京六一生物科技有限公司；酶標儀購自天津瑞澤分析儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購自北京百晶生物技術公司。

1.5 小鼠乳腺炎模型建立

將分娩7 d后12只孕鼠與仔鼠分籠，建模前3 h雌鼠禁食禁水，建模前1 h腹腔注射適量烏拉坦將小鼠麻醉。將小鼠仰臥固定在操作臺上，75%酒精棉球擦拭第4對乳腺及周圍區(qū)域皮膚，充分消毒且使其充分暴露，左手持無菌眼科鑷夾取乳頭并固定，右手用滅菌眼科剪剪除1 mm乳頭尖端，暴露乳頭導管。用微量注射器吸取0.2 mg·mL-1LPS 50 μL，沿乳頭導管緩慢灌注到乳腺內，對照組灌注相同體積PBS。LPS刺激24 h后，斷頸法處死小鼠，75%酒精消毒腹部皮膚后，沿腹中線剪開腹部皮膚，暴露第4對乳腺并收集。取適量乳腺組織浸泡在4%多聚甲醛中固定，用于H.E.染色觀察乳腺組織病理學變化，其余組織-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 乳腺組織病理學檢測

依次固定-脫水-透明-石蠟包埋-切片-切片脫蠟-蘇木精染色-伊紅染色-乙醇-二甲苯-封片，制成H.E.切片，并將染色后乳腺組織切片置于顯微鏡下觀察乳腺組織病理學變化。

①固定：將取樣乳腺組織于4℃冰箱在4%多聚甲醛溶液中固定24 h。

②脫水：將固定組織塊用PBS緩沖液清洗3次，依次放入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ中各脫水1 h。

③透明：將脫水組織塊表面乙醇吸干后依次放入二甲苯A和二甲苯B中各15 min，直至組織呈透明狀。

④浸蠟：將組織塊依次放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ中各30 min。

⑤包埋：先將石蠟熔化倒入包埋模具內，再用鑷子將浸蠟組織塊切面向下埋入熔蠟中，石蠟充分凝固變硬后取出，修整為規(guī)則長方形。

⑥切片：用切片機將包埋后石蠟切成厚度為5 μm切片，放在42℃溫水中展平并用載玻片附著，最后將切片放入60℃烘箱中過夜烘干備用。

⑦切片脫蠟：將組織切片依次放入二甲苯A和二甲苯B中各15 min，依次放入100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中各5 min，蒸餾水沖洗3次。

⑧染色：將組織切片浸入蘇木精染液中5 min，自來水中浸泡20 min返藍處理，伊紅染液中浸泡5 min。

⑨脫水、透明、封片：將組織切片依次放入80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ中各2 min脫水，經(jīng)二甲苯A和二甲苯B各處理5 min透明處理，用中性樹膠及蓋玻璃片封片。

⑩鏡檢：將染色后乳腺組織切片置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 乳腺組織中炎性細胞因子水平檢測

組織勻漿制備：將雌鼠右側乳腺組織和PBS按照1∶9（W/V，g·mL-1）加入玻璃組織勻漿器中勻漿，充分勻漿后轉移至離心管中4℃、2 000 g離心40 min，除去上層脂肪，將上清液轉移至新離心管中4℃、2 000 g離心20 min，棄去剩余脂肪，收集上清液轉移至新離心管中，測定乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平。

按照ELISA說明書，測定兩個不同處理組樣品450 nm處吸光值，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制標準曲線計算各樣本TNF-α相應濃度。每組設置3個重復樣本，每個樣本測定3個重復值。

1.8 蛋白質印跡分析

根據(jù)制造商說明，使用Western及IP細胞裂解液提取凍存在-80℃冰箱中小鼠乳腺組織中蛋白質，用BCA蛋白分析試劑盒測定蛋白質濃度。依次配膠-加樣-電泳-轉膜封閉-一抗孵育-洗膜-二抗孵育-洗膜-顯影。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離裂解產(chǎn)物中蛋白質，轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用含0.05%Tween-20PBS緩沖鹽水（PBST），添加5%脫脂牛奶緩沖液及含5%牛血清白蛋白（BSA）緩沖液，分別在搖床上室溫下封閉非磷酸化和磷酸化特異性一抗，封閉時間均為1 h；PBST清洗；特異性一抗在一抗稀釋液中稀釋比例為1∶1000，與膜在4℃冰箱中孵育過夜；PBST清洗膜；與過氧化物酶偶聯(lián)二抗在室溫下孵育1 h；采用超敏ECL化學發(fā)光試劑盒并使用化學發(fā)光成像系統(tǒng)Image Quant檢測免疫活性蛋白。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有試驗數(shù)據(jù)結果均用means±S.E.M形式表示。利用方差和Student's t-test分析任意兩組數(shù)據(jù)間差異性。P＜0.05代表差異顯著。利用Image J軟件分析Western blot結果。

2 結果與分析

2.1 乳腺組織病理變化

鏡下觀察咖啡酸對乳腺組織病理學變化的影響，試驗結果如圖1所示?？瞻讓φ战M小鼠乳腺組織學狀態(tài)見圖1A，乳腺腺泡結構完整，腺泡腔中可見乳汁著色；LPS刺激組小鼠乳腺組織病理學變化見圖1B，乳腺腺泡壁明顯增厚、水腫，腺泡腔中充滿大量嗜中性粒細胞，且可見乳腺組織中明顯充血和淤血發(fā)生；LPS+CA低劑量組小鼠乳腺組織病理學變化見圖1C，乳腺腺泡壁變薄，且無水腫現(xiàn)象，充血情況明顯改善；LPS+CA高劑量組小鼠乳腺組織病理學變化見圖1D，乳腺組織恢復正常，結構完整?？芍?，咖啡酸可改善LPS刺激小鼠乳腺組織損傷情況。

圖1 不同處理組小鼠乳腺病理組織學切片（400×）Fig.1 Histopathologic sections of different treatments of mice mammary gland（400×）

2.2 乳腺組織中炎性細胞因子檢測

利用ELISA檢測咖啡酸對小鼠乳腺組織中細胞炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平的影響，結果如圖2所示。

由圖2可知，與空白對照組相比，LPS刺激組與LPS+CA-L、LPS+CA-H組TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平顯著升高（P＜0.05），而LPS+CA組3種細胞炎性因子表達水平顯著低于LPS刺激組，且隨CA濃度升高而降低，呈明顯劑量依賴。說明咖啡酸抑制LPS刺激小鼠乳腺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6表達，進一步證明咖啡酸對LPS誘導小鼠乳腺炎有保護作用。

圖2 咖啡酸對乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6的影響Fig.2 Effects of caffeic acid on the production of inflammatory cytokine TNF-α,IL-1β and IL-6 in mammary gland

2.3 咖啡酸對小鼠乳腺組織NF-κB信號通路的影響

通過Western blot方法檢測IκB和p65蛋白的磷酸化水平，探究咖啡酸對NF-κB信號通路激活情況，結果如圖3所示。LPS刺激小鼠乳腺組織顯著激活IκB和p65蛋白磷酸化，咖啡酸則顯著降低LPS誘導p-p65和p-IκB蛋白水平，結果說明咖啡酸可顯著抑制LPS對NF-κB信號通路激活，進一步抑制炎性介質產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用。

圖3 咖啡酸對NF-κB信號通路的影響Fig.3 Effects of caffeic acid on the activation of NF-κB signal pathway

2.4 咖啡酸對小鼠乳腺組織MAPKs信號通路的影響

通過檢測p38、ERK和JNK蛋白磷酸化水平，探究咖啡酸對MAPKs信號通路影響，結果如圖4所示。LPS刺激小鼠乳腺組織顯著激活p38、ERK和JNK蛋白磷酸化，咖啡酸則顯著降低LPS誘導的pp38、p-JNK和p-ERK蛋白磷酸化水平，結果說明咖啡酸顯著抑制LPS對MAPKs信號通路的激活。

圖4 咖啡酸對MAPKs信號通路的影響Fig.4 Effects of caffeic acid on the activation of MAPKs signal pathway

3 討論與結論

病理學檢測結果顯示，LPS刺激小鼠乳腺組織可引發(fā)炎癥反應，乳腺腺泡壁增厚、水腫，腺泡腔中充滿大量嗜中性粒細胞，乳腺組織明顯充血和淤血，與Hu等研究結果一致[10]。然而，低劑量（10 mg·kg-1BW）咖啡酸處理小鼠乳腺組織腺泡壁變薄，且無水腫現(xiàn)象，充血狀況改善；高劑量（20 mg·kg-1BW）咖啡酸處理小鼠乳腺組織恢復正常，結構完整。結果說明咖啡酸可改善LPS刺激小鼠乳腺組織損傷情況。

本試驗結果表明，LPS灌注乳腺導管引起小鼠乳腺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平升高，與Alhussien等研究結果一致[11]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α是最先產(chǎn)生的炎性細胞因子，可誘導IL-6、IL-8等細胞因子生成；激活血管內皮細胞，協(xié)調免疫細胞組織募集并促進組織破壞[12]；刺激嗜中性粒細胞使其向炎癥部位聚集發(fā)揮作用，加劇炎癥反應[13]。本試研究中咖啡酸抑制乳腺炎發(fā)生過程中TNF-α過量表達，緩解炎癥反應，Zheng等研究表明下調TNF-α過度表達可改善TNF-α誘導病理過程，與本試驗結果一致[14]。IL-6和IL-1β在機體免疫調節(jié)方面也有重要作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6是LPS誘導機體發(fā)燒的基本介質[16]，對白細胞有趨化作用使其進入感染部位，加劇炎癥反應過程[17]；IL-1β是一個多功能高度炎性細胞因子，可誘導機體產(chǎn)生大量炎性細胞因子并協(xié)同其他炎性細胞因子加劇炎癥反應進程[18-19]。本試驗結果表明，咖啡酸可抑制LPS誘導小鼠乳腺組織中IL-6和IL-1β過度表達，緩解炎癥反應，牟瑞營等研究表明下調IL-6和IL-1β過度表達可改善小鼠乳腺炎癥，與本試驗結果一致[20]。由此表明咖啡酸可能通過TNF-α、IL-6和IL-1β等炎性細胞因子過量產(chǎn)生實現(xiàn)對LPS誘導的小鼠乳腺炎保護作用。

研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB和MAPKs在炎癥反應過程中可介導多種炎性細胞因子活化與釋放，是LPS信號轉導過程中兩條經(jīng)典路徑[21]。靜息狀態(tài)下，NF-κBp65-p50二聚體蛋白與NF-κB抑制蛋白IκB聚合成p65-p50-IκB三聚體，存在于細胞質中，當機體受到LPS刺激時，IκB發(fā)生磷酸化反應并降解該三聚體，導致IκB與p65-p50蛋白分離，使NF-κBp65亞基暴露并從細胞質轉移到細胞核內，與目的基因結合啟動基因轉錄，導致多種炎性細胞因子表達，誘導機體炎癥反應[22]。NF-κB參與IL-1β前體合成[23]。研究表明抑制NF-κB信號通路激活有利于抑制炎性細胞因子產(chǎn)生[24]。本試驗結果表明，咖啡酸抑制NF-κBp65和IκB蛋白磷酸化從而抑制NF-κB信號通路激活，減少炎性細胞因子表達，對LPS誘導乳腺炎具有一定保護作用。MAPKs信號通路參與調節(jié)炎性細胞因子合成與釋放，MAPKs是絲裂原激活蛋白激酶家族，其中p38、JNK、ERK是MAPKs信號通路中重要途徑，當機體受外界刺激時，使p38、JNK、ERK發(fā)生磷酸化反應激活MAPKs信號通路，啟動基因轉錄促進炎性細胞因子表達，誘導炎癥反應[25-26]。本試驗結果表明，咖啡酸通過抑制p38、JNK、ERK蛋白磷酸化，抑制MAPKs信號通路激活減少相關炎性細胞因子表達，達到對LPS誘導小鼠乳腺的保護作用。闞興池研究證明通過抑制NF-κB和MAPKs信號通路激活可實現(xiàn)對乳腺的保護作用，與本試驗結果一致[27]。此外，劉明江證實咖啡酸在細胞水平通過抑制NF-κB和MAPKs通路激活發(fā)揮抗炎作用[22]。

本文初步研究咖啡酸對LPS誘導乳腺炎的抗炎機制，結果表明咖啡酸通過降低NF-κBp65和MAPKs通路磷酸化水平發(fā)揮抗炎作用。是否存在其他信號通路與咖啡酸發(fā)揮抗炎作用尚待深入研究。