王春梅，王保勝，門晶晶，趙 鋒

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點試驗室，哈爾濱 150030）

乳腺導(dǎo)管上皮細胞和腺泡上皮細胞附著于基底膜（Basement membrane，BM）的細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）上。乳腺組織局部上皮發(fā)生細胞與細胞外基質(zhì)相互作用及上皮與間質(zhì)之間長距離通訊對乳腺發(fā)育和功能具有重要作用[1-2]。在乳腺發(fā)育階段，ECM蛋白和重塑酶表達在時間、空間上受嚴格調(diào)控。原位雜交和免疫熒光試驗表明，I型膠原、IV型膠原和層粘連蛋白-γ 2鏈表達和沉積與青春期、妊娠期乳腺上皮細胞（Mammary gland epithelial cells，MECs）增殖及間質(zhì)侵襲有關(guān)[3]。與其在導(dǎo)管伸長過程中作用一致，I型膠原蛋白主要位于乳腺導(dǎo)管內(nèi)，而IV型膠原蛋白和層粘連蛋白（Laminin，LN）則集中在端芽附近和腺泡周圍，表明這些ECM成分有助于正常腺泡生成和功能分化[3]。作為ECM主要受體，整聯(lián)蛋白將ECM與細胞骨架和信號通路相關(guān)聯(lián)，建立ECM-整聯(lián)蛋白信號軸。整聯(lián)蛋白作為微環(huán)境感受器控制細胞表型和命運決定。有條件地敲除乳腺腺泡基底側(cè)細胞整聯(lián)蛋白β1使上皮細胞喪失再生能力，并損害妊娠期導(dǎo)管分支和小葉腺泡發(fā)育，表明整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的ECM信號對于正常組織形態(tài)發(fā)生十分必要[4]。

催乳素（Prolactin，PRL）是正常MECs增殖和分化以及乳汁生成刺激所需垂體激素。PRL與MECs細胞膜表面催乳素受體（Prolactin receptor，PRLR）結(jié)合，激活JAK2-STAT5信號途徑，繼而調(diào)控乳腺細胞信號轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，即促進與分化相關(guān)基因和編碼牛乳蛋白（如β-酪蛋白）基因轉(zhuǎn)錄，而STAT5持續(xù)激活需整聯(lián)蛋白β1-層粘連蛋白相互作用[5]。

作為一種細胞外基質(zhì)，LN可影響其細胞表面受體整聯(lián)蛋白β1表達水平，通過其潛在信號樞紐作用增強BMECs對PRL信號應(yīng)答水平，上調(diào)β-酪蛋白蛋白合成[6]。報道指出，ILK與Rho GTPase家族成員（Rac1，cdc42等）均是整聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中關(guān)鍵節(jié)點[7-8]。整聯(lián)蛋白無法直接與Rac1結(jié)合，但招募信號和接頭蛋白，調(diào)節(jié)Rac1（與其他GTPase）激活。目前對整聯(lián)蛋白在MECs分化過程中如何控制GTPase功能研究較少。在分化MECs中，ILK已被確認為連接整聯(lián)蛋白和Rac1激活。利用富含層粘連蛋白基膜（Laminin-rich basement membrane，lrBM）開展體外三維培養(yǎng)時，妊娠期MECs中ILK缺失，抑制細胞分化與乳蛋白合成。ILK-/-MECs降低Rac1激活，且在PRL處理時無法刺激JAK2/STAT5信號傳導(dǎo)[9]。乳腺特異性缺失Rac1基因不影響青春期或妊娠期腺體發(fā)育[10]，用Rac1抑制劑NSC23766處理乳腺組織器官型培養(yǎng)物可抑制導(dǎo)管分支[11]，表明器官型培養(yǎng)難以完全概括體內(nèi)乳腺發(fā)育。Rac1缺失推遲乳腺退化，則歸因于溶酶體介導(dǎo)的凋亡和乳腺退化啟動所必需STAT3激活延遲[12-13]。

小鼠乳腺研究發(fā)現(xiàn)，細胞-ECM相互作用調(diào)控乳腺發(fā)育分化，整聯(lián)蛋白介導(dǎo)這一調(diào)控作用[4]。但奶牛乳腺發(fā)育分化中，細胞-ECM相互作用以及整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的相關(guān)機制尚不明確。本研究利用transwell細胞培養(yǎng)模型，模擬機體內(nèi)細胞所處極性環(huán)境，獲得奶牛乳腺上皮細胞功能調(diào)控試驗?zāi)Ｐ汀Ｍㄟ^在小室內(nèi)包被不同蛋白成分（BSA、LN、Matrigel）作為細胞培養(yǎng)底物，在分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)下，檢測整聯(lián)蛋白β1及其下游信號分子ILK與Rac1表達變化，揭示LN調(diào)控泌乳分化重要作用和信號途徑。通過添加AIIB2抗體調(diào)控整聯(lián)蛋白β1活性，確定整聯(lián)蛋白β1及下游信號分子介導(dǎo)細胞-LN相互作用調(diào)控乳蛋白合成機制。研究為進一步揭示LN如何參與經(jīng)典的泌乳調(diào)控信號途徑，了解其泌乳分化階段作用提供新見解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

本試驗采用健康泌乳期中國荷斯坦奶牛乳腺組織作為試驗原材料，膠原酶消化法分離培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞。奶牛乳腺上皮細胞經(jīng)純化培養(yǎng)后角蛋白18（Cytokeratin 18，CK18）鑒定與肌球蛋白重鏈11（Myosin heavy chain 11，MYH11）檢測。

1.1.2 試驗試劑

胎牛血清購自加拿大WISENTING公司；DMEM/F12、0.25%胰酶-EDTA消化液購自Gibco公司；Laminin、牛胰島素、牛血清白蛋白購自美國Sigma公司；氫化可的松、膜再生液、蛋白上樣緩沖液購自北京Solarbio公司；催乳素購自美國Abcam公司；SDS-PAGE快速凝膠試劑盒購自上海碧云天公司；ILK和Rac1購自美國CST公司；CSN2購自英國Biorbyt；AIIB2購自美國DSHB公司；Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser和TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ購自大連TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 原代奶牛乳腺上皮細胞CK18鑒定及MYH11陽性細胞檢測

對分離培養(yǎng)純化后細胞作CK18鑒定及MYH11陽性細胞檢測，確定是否為奶牛乳腺上皮細胞及其純度是否可用于后續(xù)試驗。制作細胞爬片，將細胞懸液以適當(dāng)濃度接種于無菌蓋玻片六孔板中，待細胞生長至60%～70%時，棄去培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS漂洗3×5 min，4%多聚甲醛固定10 min，PBST（0.1%Tween-20）漂洗3×5 min,5%BSA（PBST）37℃封閉1 h，棄去封閉液，以1∶200加入AF488標(biāo)記的CK18及MYH11抗體，4℃避光過夜。PBST漂洗3×5 min，加入1 μg·mL-1DAPI細胞核染色10 min。棄去DAPI染液，PSBT漂洗3×5 min。潔凈載玻片上滴加適量抗熒光淬滅劑，將載玻片取出，濾紙吸取載玻片上多余液體，倒置在抗熒光淬滅劑處，避免產(chǎn)生氣泡，指甲油封邊。激光共聚焦顯微鏡檢測CK18和MYH11熒光信號。

1.2.2 不同基質(zhì)上培養(yǎng)細胞

將細胞以適當(dāng)濃度接種在預(yù)先分別包被BSA 30 μg·mL-1、LN 30 μg·mL-1與 Matrigel 1∶100 的transwell上室內(nèi)，添加無血清培養(yǎng)基至1.5 mL，下室添加完全培養(yǎng)基2.6 mL。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞生長至80%～90%匯合，上下室內(nèi)培養(yǎng)基均更換為無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h，下室培養(yǎng)液更換為HIP分化培養(yǎng)液分化處理24 h。

1.2.3 細胞的AIIB2阻斷培養(yǎng)

將細胞以適當(dāng)濃度接種在預(yù)先分別包被BSA 30 μg·mL-1、LN 30 μg·mL-1與 Matrigel 1∶100 的transwell上室內(nèi)，添加無血清培養(yǎng)基至1.5 mL，下室添加完全培養(yǎng)基2.6 mL。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞生長至80%～90%匯合，上下室內(nèi)培養(yǎng)基均更換為無血清培養(yǎng)基，饑餓培養(yǎng)12 h,下室培養(yǎng)液更換為HIP分化培養(yǎng)液并分別添加AI?IB2抗體和同型IgG處理24 h。

1.3 熒光定量PCR

細胞處理24 h后，棄去培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS洗滌兩次，采用Trizol法提取細胞總RNA，使用核酸檢測儀測定總RNA的OD260/280值與濃度。其OD260/280值在1.8～2.0，說明純度較高，可用于后續(xù)試驗。應(yīng)用Prime ScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)合成引物序列使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒，作qRT-PCR反應(yīng)檢測相關(guān)基因表達量，引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列：ITGB1，F(xiàn)：5'TCAAATC CAGCCACAGCAGC3'， R： 5'CCGTGTCACATTCCAC CAAC3'；CSN2，F(xiàn)：5'CCCTAACAGCCTCCCACA3'，R：5'AGCCATAGCCTCCTTCAC3'；β-actin，F(xiàn)：5'CTG TCCCTGTATGCCTCTG3'，R：5'AT GTCAC GCACG ATTTCC3'。RT-PCR反應(yīng)程序95℃，30 s預(yù)變性。95℃，5 s；60℃，30 s；40個循環(huán)。根據(jù)ct值，以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因試驗組與對照組相對表達量，根據(jù)樣本相對表達量分析差異顯著性。

1.4 蛋白免疫印跡

各組細胞培養(yǎng)處理后棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2次，向小室內(nèi)各加入100 μL細胞裂解液，反復(fù)吹打數(shù)次，直至細胞完全裂解。冰上放置5 min，將細胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，12 000 r·min-14℃離心15 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新1.5 mL EP管，加入適量上樣緩沖液，煮沸10 min，用于后續(xù)檢測。各組蛋白樣品加入配制SDS-PAGE上樣孔中，電泳分離。

根據(jù)蛋白Marker，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至適宜NC膜，TBST配制5%脫脂奶粉對NC膜非特異性封閉2 h，將NC膜置于一抗中4℃搖床孵育過夜，隔日，取出TBST漂洗3次，每次10 min，置于二抗中37℃搖床孵育2 h。取出TBST漂洗3次，每次10 min。將NC膜置于凝膠成像儀中，均勻滴加超敏發(fā)光液，曝光獲取蛋白條帶，使用imagine Proplus 6.0讀取蛋白灰度值。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗3次重復(fù)，使用SPSS 21.0分析試驗數(shù)據(jù)顯著性；使用GraphPad Prism 8作圖。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，樣本間差異比較作t檢驗或單因素方差分析，*為差異顯著（P＜0.05），**為差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛乳腺上皮細胞生物學(xué)特性鑒定

膠原酶消化法獲得奶牛乳腺上皮細胞，純化培養(yǎng)后，通過免疫細胞熒光對其作CK18和MYH11檢測。CK18在奶牛乳腺上皮細胞中特異性表達，激光共聚焦顯微鏡檢測如圖1所示，綠色熒光為CK18，藍色熒光為細胞核。拉絲狀細胞骨架CK18信號陽性表達率表明已獲得純化奶牛乳腺上皮細胞。MYH11為腺泡肌上皮細胞分子標(biāo)志，檢測結(jié)果如圖2所示，并未檢測到MYH11陽性信號，表明分離培養(yǎng)純化后所獲得細胞為具有泌乳潛能的腺泡腔上皮細胞，可用于后續(xù)泌乳誘導(dǎo)試驗。

圖1 奶牛乳腺上皮細胞CK18鑒定Fig.1 Identification of CK18 in BMECs

圖2 奶牛乳腺上皮細胞中MYH11檢測Fig.2 Detection of MYH11 in BMECs

2.2 層粘連蛋白對奶牛乳腺上皮細胞泌乳分化的影響

2.2.1 層粘連蛋白對奶牛乳腺上皮細胞中整聯(lián)蛋白β1途徑的影響

奶牛乳腺上皮細胞分別生長在BSA、LN與Matrigel 3種不同基質(zhì)上，HIP分化培養(yǎng)液分化處理24 h后，檢測BSA、LN與Matrigel 3組細胞模型中泌乳相關(guān)基因在mRNA與蛋白質(zhì)水平表達情況。結(jié)果如圖3所示，在mRNA水平上，與BSA組相比，LN與Matrigel組中ITGB1基因表達量顯著升高（P＜0.05）。在蛋白質(zhì)水平上，與BSA組相比，LN與Matrigel組中整聯(lián)蛋白β1、ILK與Rac1蛋白合成顯著升高（P＜0.05）。

2.2.2 層粘連蛋白對奶牛乳腺上皮細胞中β-酪蛋白表達的影響

本試驗分別在mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測BSA、LN與Matrigel 3組細胞模型中β-酪蛋白的表達情況。結(jié)果如圖4所示，在mRNA水平上，與BSA組相比，LN與Matrigel組中β-酪蛋白編碼基因CSN2 mRNA表達量顯著升高（P＜0.01）。在蛋白質(zhì)水平上，與BSA組相比，LN與Matrigel組中β-酪蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）。

2.3 整聯(lián)蛋白β1活性對奶牛乳腺上皮細胞中泌乳分化的影響

2.3.1 整聯(lián)蛋β1活性對奶牛乳腺上皮細胞中泌乳相關(guān)蛋白表達的影響

AIIB2阻斷處理后，分別收集BSA、LN與Matri?gel組細胞蛋白樣品，Western blot檢測與泌乳分化相關(guān)的整聯(lián)蛋白β1下游蛋白表達情況。試驗結(jié)果如圖5所示，結(jié)果顯示，在BSA組中，與同型IgG相比，AIIB2阻斷后ILK蛋白表達量無明顯變化（P＞0.05），Rac1蛋白表達量顯著上升（P＜0.05）。在LN組中，與同型IgG相比，AIIB2阻斷后ILK蛋白表達量顯著降低（P＜0.05），Rac1蛋白表達量顯著上升（P＜0.05）。在Matrigel組中，與同型IgG相比，AIIB2阻斷后ILK與Rac1蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）。結(jié)合圖4結(jié)果，LN和Matrigel可增強整聯(lián)蛋白β1活性，提高ILK表達，阻斷抗體抑制整聯(lián)蛋白β1活性增強引起的ILK表達，阻斷抗體對于BSA組中ILK表達無明顯影響。

圖3 奶牛乳腺上皮細胞中整聯(lián)蛋白信號途徑關(guān)鍵分子表達Fig.3 Expression of key integrin signaling mediators in BMECs

圖4 奶牛乳腺上皮細胞中乳蛋白基因表達Fig.4 Expression of milk protein gene in BMECs

圖5 整聯(lián)蛋白β1活性對奶牛乳腺上皮細胞中泌乳相關(guān)蛋白的影響Fig.5 Effect of integrin β1 activity on lactation related proteins in BMECs

2.3.2 整聯(lián)蛋白β1活性對奶牛乳腺上皮細胞β-酪蛋白合成的影響

AIIB2阻斷處理后，分別收集BSA、LN與Matrigel組細胞蛋白樣品，Western blot檢測奶牛乳腺上皮細胞中β-酪蛋白含量。試驗結(jié)果如圖5所示，在BSA組中，與同型IgG相比，AIIB2阻斷后奶牛乳腺上皮細胞中β-酪蛋白含量無明顯變化（P＞0.05）。在LN組中，與同型IgG相比，AIIB2阻斷后奶牛乳腺上皮細胞中β-酪蛋白含量顯著降低（P＜0.05）。在Matrigel組中，與同型IgG相比，AIIB2阻斷后奶牛乳腺上皮細胞中β-酪蛋白含量顯著降低（P＜0.05）。結(jié)合圖4結(jié)果，LN和Matrigel可增強整聯(lián)蛋白β1活性，提高β-酪蛋白合成，阻斷抗體抑制LN和Matrigel對于β-酪蛋白合成作用，但阻斷抗體對于BSA組β-酪蛋白合成無明顯影響。

圖6 整聯(lián)蛋白β1活性對奶牛乳腺上皮細胞中β-酪蛋白合成的影響Fig.6 Effect of integrin β1 activity on the synthesis of β-casein in BMECs

3討 論

3.1 層粘連蛋白對于奶牛乳腺上皮細胞泌乳的影響

乳腺上皮細胞生長在非ECM塑料培養(yǎng)介質(zhì)上2D培養(yǎng)時，無法響應(yīng)PRL刺激，繼而激活STAT5及乳腺特異性基因表達[14]。乳腺上皮細胞對于PRL刺激反應(yīng)取決于PRLR正確暴露。在單層培養(yǎng)模型中，乳腺上皮細胞與頂端加入的PRL結(jié)合能力有限，因為PRLR沿基底外側(cè)表面分布。在體外將乳腺上皮細胞聚集體培養(yǎng)在非粘附介質(zhì)上時使PRLR暴露，與PRL結(jié)合，并在無LN情況下激活STAT5。這種短暫激活無法刺激乳腺特異性基因轉(zhuǎn)錄[15]。ECM與細胞核之間動態(tài)交互對話對于轉(zhuǎn)錄調(diào)控至關(guān)重要，當(dāng)用LN1或lrECM 3D培養(yǎng)時，MECs形成極化腺泡，PRLR暴露于PRL使STAT5持續(xù)磷酸化和高水平STAT5核轉(zhuǎn)位。LN1與細胞核溝通影響核組織和乳腺特異基因表達的信號通路仍未發(fā)現(xiàn)。近期小鼠乳腺研究表明整聯(lián)蛋白β1可能通過調(diào)控其下游信號通路蛋白FAK、ILK、Rac1等促進核轉(zhuǎn)位和/或STAT5持續(xù)激活，但在奶牛乳腺中尚不清楚。本研究中，利用transwell細胞培養(yǎng)模型，模擬機體內(nèi)細胞所處極性環(huán)境。通過上室底膜包被LN（試驗組）、BSA（對照組）與Matrigel（陽性對照組)，下室添加HIP細胞分化培養(yǎng)液，研究LN對于奶牛乳腺上皮細胞泌乳分化的影響。結(jié)果顯示，在HIP分化培養(yǎng)液處理時，與BSA組相比，LN與Matrigel組整聯(lián)蛋白β1、ILK、Rac1及β-酪蛋白翻譯水平顯著上調(diào)，整聯(lián)蛋白β1與β-酪蛋白轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)。表明HIP誘導(dǎo)乳腺上皮細胞泌乳分化時，LN可通過上調(diào)整聯(lián)蛋白β1信號通路，提高β-酪蛋白表達，促進奶牛乳腺上皮細胞泌乳分化。由此推斷LN通過與其細胞表面受體整聯(lián)蛋白β1結(jié)合激活整聯(lián)蛋白β1，并以整聯(lián)蛋白β1依賴性調(diào)控奶牛乳腺上皮細胞泌乳分化。

3.2 整聯(lián)蛋白β1活性對于奶牛乳腺上皮細胞泌乳的影響

目前常用條件缺陷方法研究整聯(lián)蛋白β1在特定組織發(fā)育和功能中作用。表皮中，整聯(lián)蛋白β1條件敲除導(dǎo)致基膜蛋白組裝缺陷，細胞增殖改變，毛囊形態(tài)發(fā)生缺陷，細胞骨架動力學(xué)受損，受傷后減少遷移和上皮再生[16]。角質(zhì)形成細胞時空分化不受影響。骨等間充質(zhì)組織中，軟骨細胞中整聯(lián)蛋白β1的條件缺陷可通過細胞與膠原蛋白和纖連蛋白異常粘附而導(dǎo)致軟骨發(fā)育不良，并通過細胞周期G1/S邊界處缺陷而減少增殖[17]。而肌肉中整聯(lián)蛋白β1條件缺失導(dǎo)致成肌細胞融合和肌節(jié)組裝缺陷。神經(jīng)組織中，整聯(lián)蛋白β1缺失也有顯著表型，例如，在神經(jīng)嵴衍生的周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，整聯(lián)蛋白β1對于雪旺細胞遷移和髓鞘形成準(zhǔn)確時間、軸突周圍維持過程及神經(jīng)肌肉連接成熟均為必需。抑制乳腺上皮細胞與基膜的接觸改變形態(tài)，存活，增殖和分化。通過使用抑制分化的功能阻斷抗體證明整聯(lián)蛋白β1在小鼠乳腺細胞功能中重要性。最近研究發(fā)現(xiàn)，小鼠基因敲除模型中已經(jīng)證實整聯(lián)蛋白β1對乳腺發(fā)育和STAT5持續(xù)激活至關(guān)重要[18]。因此提出奶牛乳腺上皮細胞中，功能阻斷整聯(lián)蛋白β1是否對細胞泌乳分化造成影響。本研究中，構(gòu)建transwell細胞培養(yǎng)模型。在分化培養(yǎng)過程中下室分別添加整聯(lián)蛋白β1功能阻斷抗體AIIB2與同型IgG，處理24 h。觀察整聯(lián)蛋白β 1功能阻斷對于泌乳分化的影響。結(jié)果顯示，LN和Matrgel存在時，整聯(lián)蛋白β1下游信號分子ILK表達及β-酪蛋白合成同步下降，表明其處于相互關(guān)聯(lián)的泌乳分化調(diào)控途徑，LN和Matrigel激活整聯(lián)蛋白β1信號途徑，再通過ILK調(diào)控影響乳蛋白合成。而BSA作為非基膜成分陰性對照，無法激活整聯(lián)蛋白β1，即使給予整聯(lián)蛋白功能阻斷抗體也不會對泌乳分化產(chǎn)生影響。

研究表明，小鼠乳腺中Rac1和ILK是介導(dǎo)整聯(lián)蛋白β1泌乳分化作用的下游關(guān)鍵信號分子，且ILK連接整聯(lián)蛋白β1對于Rac1激活[19]。在小鼠乳腺連續(xù)妊娠中，Rac1既控制乳腺分泌功能，也控制乳腺重塑。Rac1基因缺失試驗發(fā)現(xiàn)，小葉腺泡發(fā)育受損乳腺導(dǎo)管粗大，表明Rac1在調(diào)節(jié)乳腺上皮組織命運決定中發(fā)揮關(guān)鍵作用，用泌乳激素刺激體外培養(yǎng)Rac1基因缺失細胞時，乳蛋白合成能力降低[20]。但本研究中，BSA和LN作為底物時，整聯(lián)蛋白β1失活Rac1表達反而上升。表明在奶牛乳腺上皮細胞中Rac1可能與整聯(lián)蛋白β1并非上下游直接關(guān)聯(lián)，并參與其他ECM激活途徑，當(dāng)一條途徑失活引起另一條途徑反饋增強，導(dǎo)致Rac1表達不降反升；Rho GTPase與亞家族成員補償機制也造成這種現(xiàn)象[21]。由此推測其他Rho GTPase與亞家族成員與整聯(lián)蛋白β1存在上下游關(guān)聯(lián)，整聯(lián)蛋白β1失活時，該家族成員表達下調(diào)，觸發(fā)補償機制造成Rac1表達上調(diào)需后續(xù)研究驗證。Matrigel含有多種ECM，成分復(fù)雜，可能抑制反饋效應(yīng)或通過其他方式阻礙Rac1表達上調(diào)。

4結(jié)論

研究表明LN協(xié)助并促進誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細胞β-酪蛋白合成分泌上調(diào)，這種上調(diào)作用依賴整聯(lián)蛋白β1-ILK通路活性。