郭新穎，陳 峰，楊清華，戴志英，楊梅桂，顧 俊

（江蘇省南通市疾病預(yù)防控制中心 理化科，江蘇 南通 226007）

人體由于抗氧化失衡引發(fā)各種疾病的不良物質(zhì)之一是自由基，它可使細(xì)胞膜受損、蛋白質(zhì)變性、酶失去活性、脂質(zhì)過氧化等。而羥自由基（·OH）又是所有活性氧自由基中生物活性最為活躍、危害最大的一類。因此，如何有效消減清除體內(nèi)多余·OH以減緩人體衰老、增強(qiáng)人體免疫力，成為人類對(duì)抗疾病和死亡的永恒課題。天然藥物是動(dòng)物、植物和礦物等自然界中普遍存在的有藥理活性的天然產(chǎn)物，其本身具有藥效，且毒副作用比人工合成的化學(xué)藥品低得多，被稱為天然“藥片”。天然藥物因其高效安全、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，已在醫(yī)療保健、養(yǎng)生防病等方面廣泛應(yīng)用，用以研制抗病保健等抗氧化作用的天然藥物前景看好，一些具預(yù)防與保健功能的天然藥物逐漸受到青睞，成為防治各種因抗氧化失衡引起的癌癥、艾滋病、心腦血管病、糖尿病等疾病的研發(fā)熱點(diǎn)。中國(guó)擁有天然藥物寶庫(kù)，具有藥食兩用中藥的重要資源原料。如橘子、山楂、南瓜、甘藍(lán)、茉莉花和金銀花等，它們有些既屬于中藥，又是常吃的富有營(yíng)養(yǎng)的食品飲品，同屬天然藥物，亦具有良好的治病療效。目前已知的天然藥物中含有的主要抗氧化成分如橘子中的多酚類和橙皮苷[1]，山楂中的黃酮類和原花青素B2[2]，南瓜中的總酚和兒茶素類[3]，甘藍(lán)中的多酚和花色苷[4]，茉莉花中的黃酮類和多糖[5]，以及金銀花中的多酚和黃酮類[6]等等的成分篩選和檢測(cè)研究，已經(jīng)被越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注和研究。本試驗(yàn)是在新型·OH反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上對(duì)以上6種天然藥物進(jìn)行抗氧化活性分析，研究結(jié)果可為藥食同源的天然藥物、保健食品藥品和綠色食品等黃金健康產(chǎn)業(yè)開發(fā)提供重要理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品與試劑

羅丹明 B、MnSO4、H2O2、H2SO4，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為國(guó)產(chǎn)分析純；天然藥物均為市購(gòu)。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器設(shè)備

UNICO7200型分光光度計(jì)（上海分析儀器廠）；FA2004型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；XQ100粉碎機(jī)（四方儀器有限公司）；KQ-300TDB型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 樣品提取

選取水果、蔬菜、花類等6種天然藥物，洗凈、晾干、粉碎過篩。準(zhǔn)確稱取5.0g，加入50mL水，浸泡、超聲、過濾、離心，取上層清液，在4℃條件下貯存待測(cè)。

1.4 檢測(cè)方法

在比色管中按順序分別加入濃度為5.0×10-2mol·L-1的 RB 溶液 0.4mL，1.0×10-2mol·L-1的H2SO4溶 液 0.5mL，5.0×10-4mol·L-1MnSO4溶 液0.80mL和0.1%H2O2溶液1.0mL，定容至10mL，放置7min待測(cè)。同樣的，在比色管中僅加入0.4mL 5.0×10-2mol·L-1的 RB 溶液和 0.5mL 1.0×10-2mol·L-1的H2SO4溶液作為試劑空白。將加入或者未加抗氧化劑的反應(yīng)體系分別在550nm處測(cè)定吸光度值，分別記作AS和A，計(jì)算反應(yīng)體系吸光度值A(chǔ)S或者A值與空白參比吸光度A0值的差值，通過測(cè)定·OH反應(yīng)前后溶液的吸光度變化差值△A值間接測(cè)定抗氧化劑的·OH清除率。反應(yīng)體系清除率CR%的計(jì)算公式[7]：

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收曲線

在7200型分光光度計(jì)上于510～590nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)分別測(cè)定空白體系和RB-Mn2+-H2O2反應(yīng)體系溶液的吸光度值，對(duì)比溶液吸收光譜曲線可知，·OH體系可氧化RB使化學(xué)試劑產(chǎn)生褪色效應(yīng)。由于RB在550nm處吸光度值為最大，故本試驗(yàn)選擇550nm為溶液測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 試驗(yàn)影響因素分析

由于類Fenton試劑反應(yīng)體系同F(xiàn)enton反應(yīng)一樣在酸性條件下會(huì)產(chǎn)生·OH，而·OH又是鏈接反應(yīng)的有效因子，因此，類Fenton試劑的配比如反應(yīng)物Mn2+、H2O2和OH-的濃度，溶液pH值以及反應(yīng)時(shí)間共同決定了·OH的產(chǎn)量和反應(yīng)程度。本試驗(yàn)分別對(duì)反應(yīng)體系中的酸用量、RB用量、Mn2+用量、H2O2用量和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)，用于探索RB-Mn2+-H2O2檢測(cè)體系的最佳實(shí)驗(yàn)條件。

2.2.1 酸度的影響 在類Fenton試劑反應(yīng)體系中，·OH的產(chǎn)生與酸度有關(guān)，本試驗(yàn)在酸性溶液中進(jìn)行試驗(yàn)，選擇H2SO4為溶劑介質(zhì)，當(dāng)加入0.5mL 1.0×10-2mol·L-1的H2SO4溶液時(shí)，體系較穩(wěn)定、化學(xué)試劑反應(yīng)較明顯、褪色效果較好。

2.2.2 顯色劑的影響 化學(xué)顯色劑RB用量的增加會(huì)使△A值增大，但用量過大會(huì)導(dǎo)致空白參比吸光度超出正常讀數(shù)范圍，本試驗(yàn)選用濃度為5.0×10-2mol·L-1的 RB 溶液 0.4mL。

2.2.3 錳基離子的影響 在RB-Mn2+-H2O2檢測(cè)反應(yīng)體系中，當(dāng)Mn2+濃度很低時(shí)，反應(yīng)速度慢、反應(yīng)受限；當(dāng)Mn2+濃度過高時(shí)，△A值增加影響讀數(shù)，綜合考慮，本試驗(yàn)選擇 5.0×10-4mol·L-1的 MnSO4溶液0.80mL。

2.2.4 H2O2的影響 為提高H2O2利用率和氧化效果，試驗(yàn)使用0.1%的H2O2溶液。當(dāng)體積用量為1.0mL時(shí)，△A值較好。

2.2.5 時(shí)間的影響 本法的穩(wěn)定性較好，經(jīng)測(cè)試，體系在7～10min內(nèi)△A值基本無(wú)變化，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)時(shí)間調(diào)整為7min。

2.3 天然藥物提取物的抗氧化作用

本試驗(yàn)以·OH的清除能力作為評(píng)價(jià)天然藥物體外抗氧化活性的檢測(cè)指標(biāo)，試驗(yàn)中對(duì)不同種屬的水果中的橘子和山楂、蔬菜中的南瓜和甘藍(lán)、花蕾中的茉莉花和金銀花等天然藥物提取物的·OH清除能力（以清除率計(jì)）進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見表1。

由表1結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這6種天然藥物提取物均存在較強(qiáng)的抗氧化能力，但清除能力大小有差別。其中橘子、山楂和金銀花的·OH清除能力顯著高于南瓜、甘藍(lán)和茉莉花的清除能力，各種天然藥物的清除率分別為：橘子56.13%，山楂55.42%，金銀花56.97%，南瓜29.84%，甘藍(lán)37.45%，茉莉花27.58%。這6種天然藥物抗氧化能力的大小或可由其中含有的多酚類、黃酮類等已知的主要抗氧化成分所決定。

表1 天然藥物提取物對(duì)·OH清除率（n=7）Tab.1 Scavenging rate of natural medicine extracts（n=7）

3 結(jié)論

本文建立了一種新型金屬離子聯(lián)合化學(xué)試劑顯色光度法作為天然藥物體外抗氧化羥基自由基活性的快速篩選與定量檢測(cè)方法，試驗(yàn)以·OH的清除能力為體外抗氧化指標(biāo)，研究了6種天然藥物提取物的體外抗氧化活性，比較了其體外抗氧化能力的大小。同時(shí)，試驗(yàn)還探究了溶劑介質(zhì)濃度、反應(yīng)物濃度和檢測(cè)時(shí)間等因素對(duì)抗氧化物質(zhì)水提物的影響。本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，6種不同種屬的天然藥物提取物具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，可有望將其開發(fā)為功能性食品藥品或新型復(fù)合抗氧化劑等，也為開發(fā)利用水果蔬菜花蕾的多酚黃酮等天然藥物資源成分提供理論科學(xué)依據(jù)。當(dāng)然，由于本試驗(yàn)采用的原料、方法、儀器不同導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果有所差異，抑或與樣品中多酚黃酮類成分的含量相關(guān)。有關(guān)天然產(chǎn)物的抗氧化性及其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。