羅 茜，薛 紅，卞兆連*

(江蘇省南通市第三人民醫(yī)院1 肝病研究所，2 重癥感染科，南通 226006)

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是源自肝臟的惡性腫瘤，其發(fā)病率、死亡率均居于惡性腫瘤的前列。我國(guó)的HCC 發(fā)病率較高，江蘇南通等東南沿海一帶更是我國(guó)HCC 的高發(fā)區(qū)之一[1]。目前HCC的病因和發(fā)病機(jī)制仍不明確，一般認(rèn)為HCC 的發(fā)生是病毒感染、遺傳等多因素長(zhǎng)期作用的結(jié)果[2]，深入探討HCC 的發(fā)病機(jī)制顯得尤為重要。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長(zhǎng)度＞200 nt，不具備蛋白質(zhì)編碼功能的RNA分子。過去lncRNAs 被誤認(rèn)為是“轉(zhuǎn)錄噪音”而未受到重視[3]。近來(lái)研究[4]表明，lncRNAs 在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移、腫瘤血管生成等惡性生物學(xué)進(jìn)程。在HCC 的發(fā)生發(fā)展過程中，通常伴lncRNAs 的表達(dá)失調(diào)，異常表達(dá)的lncRNAs 會(huì)導(dǎo)致腫瘤不可控制地生長(zhǎng)甚至轉(zhuǎn)移[5-6]。Z.H.WANG 等[7]通過遺傳學(xué)圖譜發(fā)現(xiàn)并確定了表觀遺傳誘發(fā)lncRNA1(epigenetically induced lncRNA1,EPIC1)在乳腺癌中表達(dá)顯著升高，且與患者的不良預(yù)后相關(guān)。本研究對(duì)EPIC1 在HCC 中的表達(dá)和潛在功能進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2013年9月—2018年3月在南通市第三人民醫(yī)院肝膽外科確診為HCC 并手術(shù)切除的48 例患者的配對(duì)組織，所有患者均簽署知情同意書，并經(jīng)南通市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，其中男36 例，女12 例，平均年齡(58.38±11.22)歲。所有組織標(biāo)本離體0.5 h 內(nèi)浸泡于RNAlater 中，過夜后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱存放。收集患者的臨床病理及術(shù)前末次血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)等資料。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 從中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買人源肝癌細(xì)胞HuH-7、Hep 3B2.1-7、PLC/PRF/5、Li-7 和SK-HEP-1 以及正常肝臟上皮細(xì)胞系L-02。Li-7、L-02 細(xì)胞培養(yǎng)條件為RPMI-1640 培養(yǎng)基：90%，F(xiàn)BS：10%。HuH-7 細(xì)胞培養(yǎng)條件為高糖DMEM 培養(yǎng)基：90%，F(xiàn)BS：10%。Hep 3B2.1-7、PLC/PRF/5、SK-HEP-1 細(xì)胞培養(yǎng)條件為MEM 培養(yǎng)基：90%，F(xiàn)BS：10%。所有細(xì)胞均置于37 ℃、含5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)，每24 h 更換1 次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)開始傳代培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 RNAiso Plus(9109)、PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)(RR036A)、TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus)(RR820A)均購(gòu)自北京Takara 公司。

1.4 總RNA 的提取 取新鮮組織樣本，加入1 mL RNAiso Plus 于冰上勻漿，室溫靜置后12 000 g 4 ℃離心5 min，在上清液中加入200 μL 氯仿，上下顛倒使之乳化，12 000 g 4 ℃離心15 min，吸取上清液，向其中加入1 mL 異丙醇沉淀RNA，12 000 g 4 ℃離心30 min，再加入1 mL 75%乙醇進(jìn)行洗滌，7 500 g 4 ℃離心5 min 后棄乙醇，讓沉淀RNA 在室溫干燥后加入DEPC 水溶解，于NanoDrop-One 檢測(cè)RNA的純度及濃度。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR) 取1 μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，在冰上配制反應(yīng)體系。輕柔混勻后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件如下：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃∞。采用qRT-PCR 檢測(cè)EPIC1 的相對(duì)表達(dá)水平。反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95 ℃3 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。結(jié)果分析采用經(jīng)典的2-△△ct法進(jìn)行基因表達(dá)的相對(duì)定量。EPIC1 上游引物：5′-TACAAGCCAGGAACTGAACC-3′；下游引物：5′-ATAACAAAGCTCCACCGC-3′。內(nèi)參β-actin 上游引物：5′-CCAACCGCGAGAAGATGA-3′；下游引物：5′-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3′。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究采用IBM SPSS Statistics 24 及GraphPad prism 8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s 表示。使用配對(duì)t 檢驗(yàn)分析HCC 癌灶及鄰近正常組織之間的表達(dá)差異，使用χ2檢驗(yàn)分析EPIC1 與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 lncRNA EPIC1 在HCC組織中低表達(dá) 通過qRT-PCR 檢測(cè)HCC 和癌旁組織中EPIC1 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示EPIC1 在HCC 和癌旁組織的表達(dá)分別為(13.28±36.66)和(62.84±108.93)，肝癌組織中EPIC1低于癌旁組織(P=0.006)(圖1)。

2.2 lncRNA EPIC1 在肝癌細(xì)胞中低表達(dá) qRTPCR 結(jié)果顯示，相較于正常肝臟上皮細(xì)胞L-02，肝癌細(xì)胞中EPIC1 在5 種肝癌細(xì)胞系HuH-7(P=0.013)、Hep 3B2.1-7(P=0.001)、PLC/PRF/5(P=0.004)、Li-7(P=0.001)、SK-HEP-1(P=0.004)中的表達(dá)均明顯下降(圖2)。

2.3 EPIC1 的表達(dá)與HCC 患者病理分期相關(guān) 進(jìn)一步分析EPIC1 表達(dá)與患者性別、年齡、術(shù)前末次AFP 水平、TNM 分期、腫塊直徑、微血管侵犯(microvascular invasion,MVI)等臨床因素的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EPIC1 表達(dá)量與患者性別(P=0.505)、年齡(P=0.858)、術(shù)前末次AFP 水平(P=0.966)、腫塊直徑(P=0.551)和MVI(P=0.233)均無(wú)相關(guān)，但與TNM 分期顯著相關(guān)(P=0.033)(表1)。

表1 EPIC1 表達(dá)與患者臨床參數(shù)的相關(guān)性

3 討 論

我國(guó)作為一個(gè)“肝病大國(guó)”，每年新增的HCC 病例數(shù)占全球的一半以上，HCC 的防治工作尤為嚴(yán)峻。同時(shí)，因?yàn)镠CC 發(fā)病隱匿，患者多在體檢或肝病隨訪時(shí)B 超檢查發(fā)現(xiàn)，加之現(xiàn)有的AFP、異常凝血酶原等血清學(xué)標(biāo)志物缺乏足夠的靈敏度和特異性，給臨床上HCC 的早發(fā)現(xiàn)、早診斷帶來(lái)難度。

起初認(rèn)為lncRNAs 是不具備生物學(xué)功能的無(wú)用片段，隨著基因芯片和二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，lncRNAs 被發(fā)現(xiàn)可在染色質(zhì)構(gòu)象、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平等多個(gè)層面參與對(duì)下游分子或信號(hào)通路的調(diào)控，進(jìn)而廣泛影響生理病理過程[8]。lncRNA 常見的作用模式有：(1)作為順、反式作用元件，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄；(2)通過特定的元件結(jié)合蛋白質(zhì)分子，影響蛋白的分子活性和細(xì)胞內(nèi)定位；(3)結(jié)合胞漿中的mRNA 前體或成熟體并在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)mRNA 進(jìn)行修飾；(4)充當(dāng)miRNA 海綿，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，解除miRNA 對(duì)下游靶基因的抑制作用，從而調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)[9-11]。

大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)[11-12]表明在人體多種惡性腫瘤組織中l(wèi)ncRNAs 的表達(dá)譜發(fā)生了顯著的差異表達(dá)，lncRNAs 可參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程。HOTAIR 被證實(shí)在乳腺癌中高表達(dá)，通過結(jié)合并調(diào)節(jié)PRC2 復(fù)合物，對(duì)組蛋白甲基化修飾調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，同時(shí)HOTAIR 也是影響乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。R.Q.JIANG 等[13]通過大規(guī)模臨床樣本發(fā)現(xiàn)lnc-EGFR 與肝癌患者Treg 及CTL 亞群分布關(guān)聯(lián)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明lnc-EGFR 靶向EGFR/NFAT1 介導(dǎo)Treg/CTL 異常分布促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。

Z.H.WANG 等[7]研究表明，EPIC1 能在一定程度上增強(qiáng)MYC-MAX 兩者之間的相互作用。EPIC1 可能是通過調(diào)節(jié)MYC 上MYC-MAX 特異性的結(jié)合位點(diǎn)來(lái)影響MYC 的“占有率”，但對(duì)其他非特異性的結(jié)合并無(wú)明顯影響。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA EPIC1 在HCC組織、細(xì)胞中呈低表達(dá)，進(jìn)一步分析患者的性別、年齡、術(shù)前末次AFP 含量、腫塊直徑等臨床參數(shù)，我們發(fā)現(xiàn)EPIC1 的表達(dá)與患者的TNM 分期密切相關(guān)，但和患者的性別、年齡、AFP 含量、腫塊直徑、MVI 均不存在顯著的相關(guān)性。提示EPIC1 參與了HCC 的發(fā)生發(fā)展，但其具體的作用機(jī)制及調(diào)控機(jī)制尚不明確。深入探討EPIC1 在HCC 的具體作用機(jī)制，有利于推進(jìn)臨床闡明HCC 的發(fā)病機(jī)制，為疾病的預(yù)防和靶向治療等提供新的思路。