朱鳴鏑，趙林霞，高永靜

(1 南通大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，南通 226001；2 南通大學(xué)特種醫(yī)學(xué)研究院)

高壓氧治療(hyperbaric oxygen therapy,HBOT)是指在高壓(超過常壓)的情況下，吸入純氧以治療缺氧性疾病和相關(guān)疾病的方法。HBOT 在臨床上有多種適應(yīng)證，包括心腦血管疾病、中毒性疾病、感染、自身免疫性疾病等。近年來，HBOT 也用于治療慢性疼痛，包括慢性頭痛、纖維肌痛、復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征、三叉神經(jīng)痛等[1]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究[2-4]表明，高壓氧治療減輕了脊神經(jīng)結(jié)扎或坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛、角叉菜膠引起的急性炎癥性疼痛、完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的慢性炎癥性疼痛。但對(duì)于高壓氧鎮(zhèn)痛的機(jī)制研究還較少。

慢性炎癥性疼痛是臨床常見的慢性疼痛，表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、熱痛覺過敏和機(jī)械性觸誘發(fā)痛。慢性疼痛的產(chǎn)生與外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的可塑性變化密切相關(guān)，同時(shí)神經(jīng)元的可塑性變化也受到膠質(zhì)細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)的調(diào)控[5]。以往的研究[6]證實(shí)，表達(dá)于神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的多種激酶參與炎癥介質(zhì)的表達(dá)和釋放。在慢性疼痛狀態(tài)下，有絲分裂原蛋白激酶家族，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)，c-Jun N 末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)及p38 在脊髓的神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)升高，而鞘內(nèi)注射這些激酶相應(yīng)的抑制劑有效緩解了慢性疼痛。另外，辣椒素受體瞬時(shí)受體電位通道(transient receptor potential channels,TPRV1)是表達(dá)在背根神經(jīng)節(jié)并在疼痛中起重要作用的受體[7]。但在慢性炎癥性疼痛情況下，ERK、JNK 和TRPV1 是否在外周組織中被激活，以及HBOT 對(duì)它們激活的影響缺乏研究。我們采用小鼠足底注射完全弗氏佐劑(complete Freund′s adjuvant,CFA)誘導(dǎo)慢性炎癥性疼痛，結(jié)合2 個(gè)大氣壓的高壓氧治療，探討HBOT 對(duì)于CFA 誘導(dǎo)的痛覺過敏、組織水腫、以及對(duì)ERK、JNK 激活和TRPV1 表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和造模 雄性ICR 小鼠(體質(zhì)量20～30 g)購(gòu)自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物房，室溫(23±2) ℃，自由攝食和飲水。造模時(shí)，小鼠用異氟烷吸入麻醉，之后在小鼠左側(cè)后爪足底皮下注射20 μL CFA。實(shí)驗(yàn)經(jīng)南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑 CFA(Sigma-Aldrich 公司)；蛋白酶和磷酸酶抑制劑(Sigma-Aldrich 公司)；雙辛酸(bicinchonininc acid,BCA)法蛋白定量檢測(cè)試劑盒(Bio-Rad 公司)；p-ERK 抗體(Cell Signaling Technology)；p-JNK(Cell Signaling Technology)；TRPV1 抗體(Santa)；β-actin 抗體(Sigma-Aldrich 公司)。

1.3 高壓氧處理 用于行為學(xué)檢測(cè)的小鼠高壓氧處理方式：(1)在CFA 注射后1 h 首次將小鼠置于小動(dòng)物高壓氧艙[100%氧氣，2 個(gè)大氣壓(atmosphere absolute,ATA)]之后每天1 h，連續(xù)8 d；對(duì)照組置于常氧常壓環(huán)境1 h，處理時(shí)間同上；(2)CFA 注射后3 d首次將動(dòng)物放置于高壓氧環(huán)境或常氧常壓環(huán)境1 h，連續(xù)5 d。用于檢測(cè)足底炎癥程度和Western Blotting的小鼠，處理方式同(1)。

1.4 行為學(xué)檢測(cè) 使用IITC model 390 痛覺測(cè)量?jī)x進(jìn)行檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)前3 d，小鼠每天置于熱痛儀恒溫玻璃板上的透明有機(jī)玻璃盒中1 h，使之適應(yīng)環(huán)境。測(cè)試時(shí)，將玻璃板溫度設(shè)置為30 ℃，調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度，使正常小鼠的潛伏時(shí)間10～14 s。待小鼠安靜后，將光照點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)小鼠左后肢爪的爪中心位置，開始計(jì)時(shí)。待小鼠出現(xiàn)縮腿或舔爪時(shí)計(jì)時(shí)停止，該時(shí)間段為小鼠的縮腿潛伏時(shí)間。每只小鼠重復(fù)測(cè)量3 次，每次相隔大約5 min，取3 次的平均值作為小鼠縮腿潛伏期，數(shù)值越低表示小鼠熱痛過敏越嚴(yán)重。足底腫脹程度檢測(cè)采用plethysmometer(UgoBasile,Camerio,VA,Italy)，將小鼠輕輕抓住，將炎癥足踝關(guān)節(jié)以下置于測(cè)試儀的液體中，記錄儀器上顯示的數(shù)值。

1.5 Western Blot 將正常小鼠，CFA 后1、3 和7 d的高壓氧處理組和對(duì)照組小鼠，在異氟烷吸入麻醉下，經(jīng)左心室灌注生理鹽水30 mL，之后取足底皮膚，加入蛋白裂解液提取蛋白，經(jīng)BCA 測(cè)定蛋白濃度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳(Sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)，蛋白上樣量30 μg。待電泳完成后，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用5%脫脂牛奶封閉，之后加一抗(兔抗p-ERK，1∶500；兔抗p-JNK，1∶500；山羊抗TRPV1，1∶500；鼠抗β-actin，1∶5 000)孵育過夜。之后加相應(yīng)二抗，顯影后掃描。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析使用GraphPad Prism 5軟件，行為學(xué)結(jié)果用雙因素重復(fù)測(cè)量方差分析(Twoway RM ANOVA)。Western Blot 中的條帶采用Image J 測(cè)量灰度，以β-actin 做內(nèi)參。兩兩比較采用Student′s t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 高壓氧緩解CFA 誘導(dǎo)的熱痛覺過敏 CFA 注射后1 h，給予小鼠2 個(gè)ATA 的高壓氧處理，之后每天1 次，連續(xù)8 d。在每次高壓氧處理后的3 h，檢測(cè)熱痛覺過敏。結(jié)果顯示，高壓氧處理3 次之后，小鼠對(duì)熱刺激的縮腿潛伏期顯著增加；而且在CFA 后的第8 天，高壓氧治療停止后，疼痛程度仍顯著低于對(duì)照組。到CFA 后14 d，兩組動(dòng)物的縮腿閾值均恢復(fù)正常(圖1A)。在CFA 3 d 開始高壓氧治療的動(dòng)物，連續(xù)5 d 的治療，疼痛均緩解，在高壓氧停止后1 d 仍有效(圖1B)。表明在CFA 注射后的當(dāng)天或3 d 開始給予高壓氧治療，均能有效緩解CFA 引起的炎癥性疼痛。

2.2 高壓氧緩解CFA 誘導(dǎo)的足底組織腫脹 CFA注射后1 h 給予高壓氧治療，連續(xù)8 d。在疼痛行為檢測(cè)結(jié)束后檢測(cè)足底體積。如圖2 所示，在第4 次治療后，高壓氧組小鼠足底水腫程度顯著低于對(duì)照組。在第8 天停止高壓氧治療后(CFA 后10 d 和14 d)，足底水腫仍低于對(duì)照組(P＜0.001,n=6)，表明HBOT顯著且長(zhǎng)時(shí)間緩解CFA 引起的組織水腫。

2.3 高壓氧降低CFA 引起的p-ERK、p-JNK、TRPV1 在足底的表達(dá) 在CFA 后的1、3 和7 d 取皮膚組織進(jìn)行Western Blot。結(jié)果顯示，CFA 注射引起足底皮膚磷酸化ERK(p-ERK)、磷酸化JNK(p-JNK)和TRPV1 表達(dá)顯著增加，p-ERK 從注射后1 d 持續(xù)到3 d；p-JNK 和TRPV1 從1 d 持續(xù)到7 d。高壓氧處理后1 d，p-ERK、p-JNK 和TRPV1 的表達(dá)與對(duì)照組相比無顯著變化，但3 d 和7 d，以上3 種蛋白的高壓氧處理組比對(duì)照組顯著下降(圖3)，表明高壓氧有效降低了p-ERK、p-JNK 和TRPV1 在皮膚的表達(dá)。

3 討 論

高壓氧治療是一種非侵入性治療方法，安全性和有效性均較高，而費(fèi)用較低。多種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床治療都體現(xiàn)了HBOT 鎮(zhèn)痛的有效性。與這些結(jié)果類似，我們也檢測(cè)到HBOT 有效緩解了CFA 引起的慢性炎癥性疼痛，且無論在炎癥初期(CFA 注射當(dāng)天)還是維持期(CFA 注射后3 d)，HBOT 均能緩解熱痛覺過敏。同時(shí)，重復(fù)給予HBOT 并未出現(xiàn)耐受性，并在HBOT 停止后疼痛緩解仍持續(xù)一段時(shí)間，這些結(jié)果證明HBOT 是一種有效的鎮(zhèn)痛方法。

以往的研究[8]表明，慢性疼痛伴隨中脊髓水平膠質(zhì)細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞)的激活，同時(shí)p-JNK 和p-p38 分別在脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中特異性表達(dá)；而ERK 在不同的疼痛模型及不同的時(shí)間點(diǎn)可分別與神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞。JNK、p38 和ERK 的激活誘導(dǎo)下游的炎癥因子的表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)炎癥反應(yīng)[8]。我們?cè)?jīng)證明，HBOT 抑制了CFA 誘導(dǎo)的脊髓中星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，同時(shí)抑制了p-JNK、p-p38 和p-ERK 在脊髓的表達(dá)。而且HBOT 也降低了CFA 誘導(dǎo)的脊髓中多種炎癥因子的表達(dá)上調(diào)，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、單核細(xì)胞超化蛋白1 和干擾素誘導(dǎo)蛋白1。在體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，LPS 刺激誘導(dǎo)了多種細(xì)胞因子和趨化因子的上調(diào)，而HBOT 預(yù)處理則使這些因子的上調(diào)顯著性下降[2]。也有研究[4]證明，HBOT 不但抑制了神經(jīng)損傷引起的脊髓中星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，還抑制了背根神經(jīng)節(jié)、海馬中星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，并降低了這些組織中TNF-α 的上調(diào)。這些結(jié)果表明HBOT 可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周的背根神經(jīng)節(jié)，抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而緩解慢性疼痛。因此，本研究中HBOT 的鎮(zhèn)痛作用也可能與抑制背根神經(jīng)節(jié)和脊髓的炎癥有關(guān)。同時(shí)，我們檢測(cè)到HBOT 處理抑制了CFA 引起的皮膚中JNK 和ERK 的激活，推測(cè)HBOT 也能作用于外周組織，抑制外周炎癥反應(yīng)。

紅、腫、熱、痛是組織炎癥的重要特征，炎癥因子如TNF-α、IL-1β 和IL-6 在組織水腫的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用，能增加血管的通透性，促進(jìn)白細(xì)胞的遷移。巨噬細(xì)胞是炎癥因子的主要來源。很多證據(jù)[9-10]表明，脂多糖刺激巨噬細(xì)胞能使炎癥因子表達(dá)增加，并激活JNK、ERK、NFκB 等細(xì)胞內(nèi)激酶的激活。采用多種藥物抑制JNK、NFκB 時(shí)，巨噬細(xì)胞釋放的炎癥因子減少，外周組織中的炎癥因子表達(dá)和水腫也被抑制[10-11]。本研究中HBOT 降低了局部組織JNK 和ERK 的激活，而且明顯緩解了組織水腫，我們推測(cè)HBOT 可能通過抑制巨噬細(xì)胞中JNK 或ERK 介導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)而抑制水腫，相關(guān)機(jī)制還需要以后繼續(xù)進(jìn)行深入研究。

TRPV1 是一種非選擇性的陽(yáng)離子通道，可被辣椒素、質(zhì)子、膜來源的脂類及傷害性熱刺激所激活。TRPV1 主要表達(dá)于外周傷害性神經(jīng)元，但藥理學(xué)研究[12-14]顯示，全身性或中樞性給予TRPV1 拮抗劑緩解炎癥性疼痛、神經(jīng)病理性疼痛和術(shù)后疼痛。最近研究[15]表明，TRPV1 拮抗劑注射到損傷神經(jīng)或該神經(jīng)所支配的后爪能緩解神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的熱痛覺過敏，支持TRPV1 在外周參與痛覺過敏。由于TRPV1 通道的開放，促進(jìn)鈣離子的內(nèi)流，從而激活JNK 和ERK[16]，因此HBOT 可能通過抑制TRPV1 的表達(dá)抑制JNK 和ERK 的激活，從而發(fā)揮抗炎和鎮(zhèn)痛作用。

綜上所述，采用CFA 誘導(dǎo)的小鼠慢性炎癥性疼痛模型結(jié)合高壓氧治療的結(jié)果證實(shí)了HBOT 對(duì)疼痛和局部組織水腫的緩解作用，而且可能與抑制外周組織中TRPV1 的表達(dá)及ERK 和JNK 的激活有關(guān)。本研究為臨床上使用高壓氧治療慢性疼痛提供的基礎(chǔ)研究證據(jù)。