武瑞娜 羅世菊 賽珊 趙聚萍 李曉捷

摘?要：針對海帶（Saccharina japonica）配子體保存過程中嚴重污染材料的分離純化進行研究。（1） 液相培養(yǎng)分離純化法：將克隆材料經(jīng)超聲波細胞粉碎儀打碎后重新附著到90 mm培養(yǎng)皿中，利用微毛細吸管在顯微鏡下分離出狀態(tài)好且無菌絲附著的細胞段，繼續(xù)保存。（2） 固相培養(yǎng)分離純化法：將克隆材料4 000 r/min離心5～10 min，棄上清，加滅菌PESI培養(yǎng)液重新懸浮藻液，利用5 mL無菌注射器吸取2 mL粉碎后的配子體細胞，逐點注射入固相平板上，接種后利用Parafilm封口膜密封培養(yǎng)皿，平板培養(yǎng)約60～120 d后觀察，將未長出菌落且藻斑直徑達2 mm的克隆團挑出，然后在PESI液體培養(yǎng)基中復蘇繼續(xù)保存。

關(guān)鍵詞：海帶（Saccharina japonica）;配子體;液相培養(yǎng);固相培養(yǎng);分離純化

海帶（Saccharina japonica）自然分布于太平洋和大西洋北部沿海，是一種冷水性大型經(jīng)濟食用海藻。1927年從日本海域引入我國海域[1-2]，然后漸漸適應了我國的海洋環(huán)境條件。大型的葉狀體孢子體世代和微小的配子體世代是海帶典型異形世代交替生活史中的兩個世代[3]，葉狀體為二倍體，配子體為單倍體。

海帶配子體是海帶種質(zhì)資源的重要保存形式，海帶配子體在保存過程中會存有細菌和真菌污染，嚴重影響了海帶配子體的正常生長和保存，甚至導致海帶優(yōu)良種質(zhì)的丟失。本論文主要圍繞保存過程中嚴重污染海帶配子體的分離純化方法進行研究。

1?材料和方法

1.1?材料及培養(yǎng)基的制備

實驗材料：本實驗室保存過程中被細菌和真菌污染嚴重的配子體克隆。

實驗器材：智能型超聲波細胞粉碎機，顯微鏡（Olympus），孔徑約500 μm的微毛細吸管（利用酒精噴燈在通風櫥內(nèi)將玻璃滴管拉制成的），15 mL玻璃材質(zhì)的試管，250 mL玻璃材質(zhì)的藍蓋瓶，滅菌的脫脂棉，離心機，蘇州凈化設備有限公司出產(chǎn)的超凈工作臺，5 mL無菌注射器。

液相培養(yǎng)基：取經(jīng)過24 h黑暗沉淀的海水，經(jīng)過二次砂濾，再經(jīng)pp棉濾芯棒過濾到5 L的三角燒瓶中，煮沸后冷卻至室溫，加入營養(yǎng)液搖勻，放置在超凈工作臺內(nèi)采用平板濾器抽濾到250 mL藍蓋瓶中備用。

固相培養(yǎng)基：配制1%瓊脂的PESI培養(yǎng)基，高壓滅菌，待冷卻至60 ℃后，用直徑9 cm的培養(yǎng)皿倒平板。

1.2?實驗方法

1.2.1?液相培養(yǎng)分離純化?將克隆材料經(jīng)超聲波細胞粉碎儀打碎后經(jīng)雙層300目篩絹過濾到90 mm培養(yǎng)皿中，鏡檢每個視野約5～8個細胞段，添加培養(yǎng)液至30 mL，放置到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約7～10 d后進行分離。在超凈工作臺內(nèi)，用微毛細吸管在顯微鏡下挑選單個、狀態(tài)較好、沒有菌絲附著的細胞段，放置在5 mm×5 mm的小蓋玻片上，通過顯微鏡檢查，細胞段細胞狀態(tài)好、無污染且僅一個細胞段，然后用鑷子將鏡檢合格的玻片轉(zhuǎn)移到盛有抽濾海水培養(yǎng)液的試管里，試管用滅菌的脫脂棉封口，貼上標簽，20支試管為一扎，用皮筋捆好，放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)進行24 h光照培養(yǎng)，約30 d換水一次，換水期間若發(fā)現(xiàn)有長菌的試管及時挑出丟棄，保留干凈無污染的試管，待細胞段長到米粒大小的克隆團時，用玻璃棒碾碎后，再次進行鏡檢，確保無污染，可作為長期保存對象。

1.2.2?固相培養(yǎng)分離純化?將打碎的細胞段利用離心機4 000 r/min離心藻液5～10 min，棄上清，加滅菌PESI培養(yǎng)液重新懸浮藻液，在超凈工作臺中，利用5 mL無菌注射器吸取2～3 mL粉碎后的配子體細胞藻液，逐點注射入固相平板上，接種后利用Parafilm封口膜密封培養(yǎng)皿; 固相保存溫度6～10 ℃，光強1 000～1 500 lx，24 h光照;每隔30 d觀察一次，及時將長出菌落嚴重的平板挑出丟棄，平板培養(yǎng)約60～120 d后觀察，將未長出菌落且直徑達1～2 mm的藻斑挑出，取得絲狀藻團于PESI液體培養(yǎng)基中，在溫度7～10 ℃、光強1 000～1 500 lx、光時24 h的條件下復蘇培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)入海水培養(yǎng)液中繼續(xù)保存，作為保種材料。

2?結(jié)果

2.1?液相培養(yǎng)分離純化

液相分離純化可以重新分離得到無污染的配子體克隆（圖1）。本次實驗共分離30支試管，保存下來18支，經(jīng)過反復鏡檢篩選最后9支試管作為保種材料，成功率約30%。

2.2?固相培養(yǎng)分離純化

固相培養(yǎng)分離純化可以篩選出無污染藻團（圖2）。本次實驗共接種10個平板，約接種90～120個細胞段，成功轉(zhuǎn)出20個藻團，鏡檢篩選再分離，最后有10個藻團作為保種材料。

3?討論

在海帶配子體保存過程中，對發(fā)生污染的配子體克隆采用液相培養(yǎng)分離純化法，進行分離純化，在分離前先用超聲波細胞粉碎儀對污染藻團進行處理，超聲波對克隆細胞有一定的傷害作用，且隨著輸出功率和處理時間的增加而提高[4]，所以需要把握好合適的功率和處理時間。液相培養(yǎng)分離純化是一種可以得到純凈種質(zhì)的方法，但有時也不能完全去除污染，所以純化得到的種質(zhì)要先觀察培養(yǎng)，反復鏡檢，觀察一段時間后，確保無污染才能進入保存機制，作為保種材料。

固相培養(yǎng)分離純化法也是一種可以得到純凈種質(zhì)的方法，同樣有時也不能完全去除污染，此法得到的種質(zhì)也要先觀察培養(yǎng)，反復鏡檢，觀察培養(yǎng)一段時間后，確保無污染才能進入保存機制，作為保種材料。

參考文獻：

[1]

李宏基.中國海帶養(yǎng)殖若干問題[M].北京：海洋出版社，1996：3-14.

[2] Tseng C K.Algal biotechnology industries and research activities in China [J].Journal of Applied Phycology，2001，13：375-380.