(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266003 1 心內(nèi)科； 2 急診內(nèi)科)

動脈粥樣硬化(AS)是血管壁的一種慢性、進行性炎性疾病，是心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)[1-3]。由于其高發(fā)病率及慢性病程等特點，對患者自身、家庭和社會都造成了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[4-5]。血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)作為動脈壁的主要成分，在正常血管中增殖率極低，但在AS早期及血管損傷后卻表現(xiàn)出較高的增殖率。研究表明，VSMCs異常增殖在AS的發(fā)病及進展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6-8]。因此，如何控制或逆轉(zhuǎn)VSMCs異常增殖對AS的防治有著重要意義。CDK9是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)家族中重要的一員，在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮著重要的作用。和其他主要調(diào)控細(xì)胞周期的CDKs不同，CDK9主要通過與細(xì)胞周期蛋白T1結(jié)合形成正性轉(zhuǎn)錄延長因子b復(fù)合物(P-TEFb)，增強RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄活性，促進RNA合成以促進細(xì)胞的生長和分化[9-11]。越來越多的研究表明，CDK9與艾滋病、腫瘤以及心血管疾病等多種疾病相關(guān)。在腫瘤治療中，已有以CDK9為靶點的抑制劑的相關(guān)報道[12-14]。根據(jù)上述研究可以推測抑制CDK9的表達(dá)可能會降低VSMCs的增殖。本研究旨在探索CDK9對VSMCs增殖的影響、調(diào)控機制及其相關(guān)臨床意義?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人主動脈VSMCs購自美國ATCC公司。

1.2 儀器與試劑

CDK9小干擾RNA(CDK9-siRNA)及CDK9陰性對照(CDK9-NC)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計并合成，所需引物由青島華大基因研究院合成，TRIzol試劑、Lipofectamine 2000試劑購自美國Invitrogen公司，cDNA反轉(zhuǎn)試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit)購自日本Takara公司，SYBR以及CCK-8試劑盒購買于上海翊圣生物科技有限公司，EDU試劑盒購買于廣州銳博生物科技有限公司，PAGE凝膠制備試劑盒(12.5%)購自上海雅酶生物科技有限公司，CDK9一抗購自美國CST公司，PCNA一抗購自美國Protein tech公司。多功能酶標(biāo)儀、PCR擴增儀及實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司，熒光倒置顯微鏡購自日本Nikon公司，F(xiàn)usion SoloS 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自法國Vilber公司。

1.3 對象及分組

選取2018年3月—2019年2月于我院體檢中心體檢健康者外周靜脈血(A組)及住院冠心病患者外周靜脈血(B組)各20例為研究對象。A組納入標(biāo)準(zhǔn)：未發(fā)現(xiàn)任何疾病的健康體檢者。B組納入標(biāo)準(zhǔn)：冠狀動脈造影顯示任一主要心外膜冠狀動脈(包括左主干、左前降支、左旋支或右冠狀動脈)狹窄≥50%者。A組男9例，女11例，平均年齡(24.45±2.61)歲；B組男11例，女9例，平均年齡(67.80±9.08)歲。于清晨空腹采集肘靜脈血，分離血清，置于-80℃冰箱儲存?zhèn)溆?。同期收集遺體捐獻(xiàn)者的正常頸動脈內(nèi)膜組織(C組)及行頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)患者的頸動脈粥樣硬化斑塊組織(D組)各6例，組織標(biāo)本收集后立即放入液氮保存。C組男3例，女3例，平均年齡(34.00±5.40)歲；D組男5例，女1例，平均年齡(61.17±4.83)歲。本研究獲我院倫理委員會批準(zhǔn)，并遵循赫爾辛基宣言原則。所有研究對象或委托人均簽署了知情同意書。

1.4 研究方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染 VSMCs在常規(guī)復(fù)蘇后，置于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM/高糖培養(yǎng)基中于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，48 h后待細(xì)胞融合達(dá)95%時傳代。按實驗需要取生長至對數(shù)期的細(xì)胞分為陰性轉(zhuǎn)染組(E組)和CDK9敲低組(F組)，其中E組轉(zhuǎn)染CDK9-NC和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000，F(xiàn)組轉(zhuǎn)染CDK9-siRNA和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000。

1.4.2實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測CDK9、PCNAmRNA表達(dá) 以Trizol法提取A、B、C、D、E、F組中總RNA，采用吸光度測定法檢測所有樣本A260/A280比值，以A260/A280比值1.8～2.0為滿足實驗要求。然后使用PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA合成。同時按照SYBR試劑盒說明書配制20 μL反應(yīng)體系，使用RT-qPCR儀進行擴增。分別檢測A、B、C、D、E、F組樣本中CDK9 mRNA表達(dá)量及E、F組樣本中PCNAmRNA表達(dá)量。以GAPDH作為內(nèi)參照，采用2-△△CT法計算CDK9及PCNAmRNA相對表達(dá)量。GAPDH上游引物序列：5′-GTCTCCTC-TGACTTCAACAGCG-3′，GAPDH下游引物序列：5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′；CDK9上游引物序列：5′-CCATTACAGCCTTGCGGGAGA-T-3′，CDK9下游引物序列：5′-CAGCAAGGTCAT-GCTCGCAGAA-3′；PCNA上游引物序列：5′-CA-AGTAATGTCGATAAAGAGGAGG-3′，PCNA下游引物序列：5′-GTGTCACCGTTGAAGAGAGTGG-3′。

1.4.3EDU及CCK-8實驗檢測細(xì)胞增殖情況 取對數(shù)生長的細(xì)胞，接種于96孔板中(1 000個細(xì)胞/孔)，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁生長后，E、F組分別轉(zhuǎn)染CDK9-NC及CDK9-siRNA，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每組設(shè)3個復(fù)孔。EDU實驗：轉(zhuǎn)染24 h后，將100 μL EDU染液加入到每孔中，室溫避光，脫色搖床孵育30 min后，再于每孔中加入100 μL Hoechst染料試劑，室溫避光，脫色搖床孵育30 min；1×PBS洗去染液，于熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞EDU攝取情況并照相，使用ImageJ 1.5.1軟件測量E、F組吸光度值。CCK-8實驗：轉(zhuǎn)染24 h后，加入10 μL CCK-8溶液加于各孔中，37 ℃下孵育1 h，采用多功能酶標(biāo)儀測量每孔在450 nm處的吸光度值。

1.4.4Western blotting方法檢測E、F組中CDK9和PCNA蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染24 h后提取E、F組蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度。按照PAGE凝膠制備試劑盒說明制膠，每孔上樣40 μg蛋白，120 V恒壓電泳1.5 h，取出凝膠100 V恒壓轉(zhuǎn)膜1.5 h，然后使用體積分?jǐn)?shù)0.05脫脂牛奶(TBST配制)室溫封閉PVDF 膜1 h，TBST洗滌1次后置于CDK9、PCNA一抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次(每次10 min)，后置于二抗(1∶5 000)中室溫孵育1 h，再次用TBST洗滌3次(每次10 min)，最后使用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，采用Fusion SoloS 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)掃描蛋白條帶，使用ImageJ 1.5.1軟件測量CDK9、PCNA蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 臨床樣本中CDK9 mRNA表達(dá)量的比較

本研究RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，A、B、C、D組中CDK9 mRNA表達(dá)量分別為0.59±0.22、1.66±0.56、1.23±0.55、3.23±0.89。A組與B組、C組與D組中CDK9 mRNA表達(dá)量比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.94、4.79，P<0.05)。

2.2 轉(zhuǎn)染CDK9-NC、CDK9-siRNA對VSMCs中CDK9表達(dá)的影響

本研究RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，E組、F組中CDK9 mRNA表達(dá)量分別為1.03±0.03、0.079±0.05，兩組比較差異有顯著性(t=30.33，P<0.05)。Western blotting檢測結(jié)果顯示，E、F組中CDK9蛋白相對表達(dá)量分別為0.96±0.07、0.12±0.05(圖1)，兩組比較差異有顯著性(t=16.39，P<0.05)。

圖1 轉(zhuǎn)染CDK9-siRNA后對VSMCs中CDK9蛋白表達(dá)的影響

2.3 敲低CDK9對VSMCs增殖的影響

EDU實驗結(jié)果顯示，E組和F組平均吸光度值分別為0.13±0.01、0.05±0.01，F(xiàn)組較E組EDU攝取能力明顯減弱(圖2)，兩組比較差異具有顯著性(t=13.13，P<0.05)。CCK-8實驗結(jié)果示E組和F組450 nm處吸光度值分別為2.56±0.31、1.29±0.09，兩組比較差異有顯著性(t=6.78，P<0.05)。

2.4 敲低CDK9對PCNA表達(dá)的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，E、F組中PCNAmRNA相對表達(dá)量分別為1.01±0.04、0.65±0.07，差異有顯著性(t=8.14，P<0.05)。Western blotting檢測結(jié)果顯示，E、F組中PCNA蛋白相對表達(dá)量分別為0.97±0.05、0.28±0.08，同E組相比F組中PCNA蛋白的表達(dá)量顯著下降，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.62，P<0.05)。

E：E組，F(xiàn)：F組，100倍

圖2 CDK9敲低對VSMCs增殖的影響

3 討 論

在我國由于人口老齡化趨勢等因素的影響致使心血管病患病率持續(xù)上升，其中以AS為基礎(chǔ)病變的腦卒中和冠心病死亡率居于首位，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了腫瘤及其他疾病[15-17]。許多研究發(fā)現(xiàn)VSMCs與AS疾病有密切相關(guān)性，對VSMCs生物學(xué)功能的研究越來越引起臨床關(guān)注。在正常生理狀態(tài)下，動脈中的VSMCs形態(tài)呈紡錘形，表現(xiàn)為收縮表型，然而在病理條件刺激下可向合成表型轉(zhuǎn)換，產(chǎn)生促炎遞質(zhì)以促進其增殖，VSMCs的異常增殖和慢性炎癥反應(yīng)的反復(fù)刺激最終致使血管管腔的狹窄，產(chǎn)生相關(guān)并發(fā)癥[18-19]。因此，研究調(diào)控VSMCs增殖的靶分子及其機制對AS的防治具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，A與B組以及C與D組相比較，CDK9 mRNA在B組和D組中顯著升高，推測在AS的病理過程中CDK9可能發(fā)揮了調(diào)控作用。CDK9在哺乳動物細(xì)胞中廣泛存在，在多種人類疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。CDK9可通過促進原癌基因MYC轉(zhuǎn)錄而參與多種腫瘤的發(fā)生[20-21]。有研究表明，在髓系白血病中抑制CDK9可導(dǎo)致髓樣細(xì)胞白血病-1(Mcl-1)和X連鎖凋亡抑制蛋白的表達(dá)下降，從而促進癌細(xì)胞凋亡。同時，CDK9也可通過調(diào)控p53基因磷酸化而促使腫瘤發(fā)生。目前，已有多種小分子CDK9抑制劑進入了臨床研研究，并顯示出良好的治療效果[22-24]。除腫瘤外，CDK9還參與其他疾病的發(fā)病，如HIV、炎癥和心肌肥大[25]。研究顯示，在炎癥中CDK9可通過調(diào)控Mcl-1蛋白的表達(dá)而影響中性粒細(xì)胞凋亡，進而影響炎癥的結(jié)局[26]。對小鼠和斑馬魚動物模型的研究結(jié)果顯示，CDK9的激活會導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大。在心臟胚胎發(fā)育過程中，使用CDK9抑制劑適度抑制CDK9的表達(dá)可使心室變小和心室射血分?jǐn)?shù)降低，并顯著減少心肌細(xì)胞的數(shù)量，這表明CDK9抑制劑可能會成為治療心血管疾病的潛在藥物[27-28]。但CDK9與VSMCs之間的調(diào)控關(guān)系目前尚不清楚。

VSMCs的異常增殖一直被認(rèn)為是AS發(fā)生的重要因素。在AS早期，VSMCs從收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)換，并分泌細(xì)胞外基質(zhì)及釋放炎癥信號的能力增強，進而促進AS的進展[29]。在本研究中，使用CDK9-siRNA在VSMCs中敲低CDK9，實驗結(jié)果顯示F組中CDK9蛋白和mRNA表達(dá)水平均較E組明顯下降，提示在轉(zhuǎn)染CDK9-siRNA后CDK9被顯著敲低。進一步通過EDU和CCK-8實驗證明，在CDK9敲低后VSMCs增殖受到了明顯抑制。以上實驗結(jié)果均表明，CDK9在AS中可能通過參與VSMCs增殖的調(diào)控而影響AS進程。本研究進一步探討了CDK9可能的下游調(diào)控機制。PCNA作為DNA復(fù)制的分子標(biāo)記，在細(xì)胞生長、維持細(xì)胞基本功能等過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用，被認(rèn)為是維持細(xì)胞增殖必不可少的調(diào)控蛋白，可以作為細(xì)胞增殖能力的檢測指標(biāo)[30]。本研究檢測了CDK9敲低后VSMCs中PCNA的表達(dá)量，研究結(jié)果顯示在CDK9敲低后PCNAmRNA和蛋白的表達(dá)量顯著降低，提示CDK9可能是通過調(diào)控PCNA表達(dá)而發(fā)揮對VSMCs增殖的調(diào)控作用，CDK9可能是VSMCs增殖調(diào)控的潛在靶點。

綜上所述，本研究證實了CDK9在冠心病患者血清及人頸動脈粥樣硬化斑塊組織中表達(dá)上調(diào)。體外實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染CDK9-siRNA可顯著下調(diào)VSMCs中CDK9的表達(dá)；在CDK9敲低后，VSMCs增殖受到顯著抑制并使PCNA的表達(dá)量下降。據(jù)此得出結(jié)論，在AS中CDK9可能通過調(diào)控PCNA的表達(dá)而參與VSMCs增殖的調(diào)控。這些結(jié)果可能為VSMCs異常增殖性疾病的精準(zhǔn)治療提供新的靶點和新的思路。