(1 山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院山東省口腔組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250012； 2 山東大學(xué)齊魯醫(yī)院口腔科；3 山東大學(xué)齊魯醫(yī)院心血管重構(gòu)與功能研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 4 徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科)

組織形態(tài)研究中常常涉及含有各類植入物的軟硬組織，例如含有鈦合金種植釘或者骨粉的頜骨、股骨組織，含有熒光素標(biāo)記的骨組織，以及含有金屬支架的血管肌肉組織等，該類組織因其植入物的特殊性，無法按照常規(guī)的石蠟切片流程將其制成組織切片。常規(guī)的石蠟切片在處理該類組織時具有以下弊端：①無法切割金屬種植體；②采用脫鈣技術(shù)以降低組織的硬度[1-3]，脫鈣會引起骨組織皺縮，從而導(dǎo)致骨組織與植入物分離；③熒光標(biāo)記的組織內(nèi)熒光標(biāo)記物與新骨鈣鹽螯合，脫鈣技術(shù)會導(dǎo)致熒光標(biāo)記物流失[4-6]，嚴(yán)重影響結(jié)果分析[7]。因此普通的石蠟切片已經(jīng)無法滿足實(shí)際需求。以EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)為代表的軟硬組織切磨技術(shù)則可以解決這一問題[8]。本研究擬將不能用常規(guī)方法制備的含有不同植入物的組織，應(yīng)用EXAKT硬組織切磨技術(shù)進(jìn)行制作后，觀察是否能夠保持組織本身及植入物與組織之間的原有組織形態(tài)，從而評價該技術(shù)對含有不同植入物組織類型的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 含有鈦合金螺紋種植釘?shù)谋雀袢骂M骨組織(A組織)、含有鈦合金直釘?shù)男∈蠊晒墙M織(B組織)、含有鈦合金螺紋種植釘?shù)男∈蠊晒墙M織(C組織)、含有多孔鈦材料的兔股骨踝骨組織(D組織)、含有鈷鉻合金支架的兔心血管組織(E組織)、含有鈣黃綠素和茜素絡(luò)合復(fù)合物標(biāo)記的大鼠上腭組織(F組織)。

1.1.2主要儀器 EXAKT 300CP/400CS/AW硬組織切磨系統(tǒng)購自德國EXAKT公司，該系統(tǒng)包括組織切片機(jī)、組織磨片機(jī)、載片真空吸附裝置、光固化包埋機(jī)、組織脫水浸潤儀、數(shù)顯千分尺等。

1.2 研究方法

1.2.1組織固定 將上述6種新鮮組織標(biāo)本置于40 g/L的多聚甲醛固定液中，于低溫(4 ℃)下固定24～48 h，具體固定時間視組織切塊大小調(diào)節(jié)，固定結(jié)束后流水沖洗24 h。

1.2.2組織脫水、浸潤與包埋 將組織塊置于體積分?jǐn)?shù)0.50、0.70、0.95、0.95、1.00、1.00乙醇溶液中并逐級上行脫水，每級脫水12 h；脫水結(jié)束后將組織逐級浸入體積分?jǐn)?shù)0.50、0.30的無水乙醇光固化樹脂(Technovit 7200VCL)中，每級浸潤時間3～5 d，最后浸入純光固化樹脂Ⅰ以及Ⅱ中，每級浸潤時間5～7 d。將經(jīng)過充分浸潤的組織置于尺寸合適的包埋模內(nèi)，倒入光固化樹脂，將包埋模放在光固化包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行聚合。先使用低強(qiáng)度光源照射，使包埋劑聚合約4 h；再使用高強(qiáng)度的藍(lán)光照射使?jié)B透到組織內(nèi)的包埋劑完全固化，聚合時間視組織塊的大小和厚度而定，約4～10 h。

1.2.3粘接載片 切割組織塊獲得目的切面，在下載片上滴粘合劑(Technovit 7210VLC)將組織塊的非切割面與下載片粘合，光固化10 min。將組織塊吸附在切片機(jī)夾具上，通過金剛鋸條切割獲得目的切面。將組織塊吸附于磨片機(jī)對目的切面進(jìn)行打磨拋光。用真空精密吸附壓機(jī)將平行載片粘接到拋光后組織面上，粘合劑為Technovit 7210VLC，粘合劑要適量，不要產(chǎn)生氣泡，光固化10 min。

1.2.4制作實(shí)驗(yàn)組織的切磨片 將組織塊粘合有實(shí)驗(yàn)組織的下載片吸附于切片機(jī)的夾具上，調(diào)節(jié)夾具位置，從上載片一側(cè)切割得到厚約200 μm的切片。將切割得到的厚片吸附于磨片機(jī)上，用各級砂礫的砂紙對切片進(jìn)行打磨，得到預(yù)期厚度，最后用細(xì)砂紙對切片進(jìn)行拋光。

1.2.5實(shí)驗(yàn)組織切片染色 A和B組織切片先進(jìn)行Ladewig染色，鐵蘇木素AB液1∶1混合后，染色5 min(現(xiàn)用現(xiàn)配)，流水沖洗5 min, Ladewig混合液染色5 min，流水沖洗至合適的顏色，自然干燥后中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。C、D、E組織切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，滴加蘇木精于切片表面，染色5 min，流水沖洗多余染液后將切片置于體積分?jǐn)?shù)0.01鹽酸乙醇中分化30 s，流水沖洗后浸入伊紅復(fù)染3 min，再流水沖洗多余染料后自然干燥，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.6F組織行熒光素標(biāo)記并熒光顯微鏡觀察 將F組織切片置于載物臺，分別選擇藍(lán)光和綠光激發(fā)，觀察鈣黃綠素和茜素絡(luò)合物發(fā)光效果并拍照，利用組合通道將圖片進(jìn)行疊加。

2 結(jié) 果

2.1 A、B組織切片Ladewig染色結(jié)果

A、B組織Ladewig染色后邊緣軟組織呈黃色，骨組織呈藍(lán)色。A組織切片在光學(xué)顯微鏡下觀察顯示種植體(黑色)與骨組織(藍(lán)色)結(jié)合緊密，螺紋附近均為新生骨(紅色箭頭處)，染色較均勻(圖1a)。B組織切片在光學(xué)顯微鏡下觀察顯示種植體(黑色)與骨組織(藍(lán)色)結(jié)合緊密，邊緣軟組織保留完整，切片無雜質(zhì)無劃痕(圖1b、c)。

2.2 C、D、E組織切片蘇木精-伊紅染色結(jié)果

C、D、E組織切片蘇木精-伊紅染色后，細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞漿呈紅色，新生骨組織一般呈淺紅色。C組織切片在光學(xué)顯微鏡下觀察示種植釘螺紋(黑色)附近有大量新生骨(綠色箭頭處)，新生骨小梁(黃色箭頭處)靠近種植釘生長，舊骨髓腔內(nèi)疏松軟組織(淺黃色)清晰可見，整體染色均勻(圖1d、e)。D組織切片在光學(xué)顯微鏡下觀察顯示鈦材料(黑色)與原舊骨(深紅色)結(jié)合緊密，而且周圍明顯附著大量的新生骨(綠色箭頭處)，種植體無移動脫落現(xiàn)象，原舊骨無缺損，腔內(nèi)疏松軟組織(淺黃色)清晰完整(圖1f、g)。E組織切片在光學(xué)顯微鏡下觀察顯示，支架材料(黑色)保持在原位，無脫落現(xiàn)象，血管壁(淺紅色)分層明顯無缺損(圖1h、i)。

2.3 F組織的熒光顯微鏡觀察結(jié)果

熒光顯微鏡下F組織切片的鈣黃綠素(綠色)和茜素絡(luò)合物(紅色)所發(fā)出的熒光清晰可見(圖1j、k)，通道疊加圖可清晰看到熒光分布和走向(圖1l)。

3 討 論

硬組織切片技術(shù)是近年來快速發(fā)展起來的一種新興技術(shù)，無需脫鈣處理，組織經(jīng)固定、脫水、包埋、切片、磨片與染色后制成切片，既縮短了制片周期，又保護(hù)了組織的完整性，因高效快捷而迅速被推廣應(yīng)用[9-14]。因?yàn)镋XAKT硬組織切磨系統(tǒng)的切割帶含有等粒徑金剛石顆粒，磨片用的砂紙含有碳化硅顆粒，硬度較高，可以用來切割鈦合金或鈷鉻合金等硬度較高的種植體，制成的切片厚度均一，組織結(jié)構(gòu)形態(tài)保持完好，染色后可以通過光學(xué)顯微鏡下觀察，也可以通過電鏡下觀察；還可用于切割纖維樁等材料，而且切出的材料厚度均勻一致，表面光滑，無需打磨，所以該技術(shù)在組織切片制作中成為更多科研工作者的首選[15-16]。硬組織切片染色方法較多，常用的有甲苯胺藍(lán)染色、蘇木精-伊紅染色、Ladewig染色、Van-Gieson染色、Giemsa染色等[17-19]，通過對顏色、位置、骨界面定量分析，可以觀察牙結(jié)石、齲病的發(fā)生、種植體與骨組織的結(jié)合、新骨生成、血管炎癥反應(yīng)、種植體表面成骨的細(xì)微變化等情況。

a:A組織切片Ladewig染色結(jié)果(100倍)；b、c：B組織切片Ladewig染色結(jié)果(4、100倍)；d、e：C組織切片蘇木精-伊紅染色結(jié)果(4、100倍)；f、g:D組織切片蘇木精-伊紅染色結(jié)果(4、100倍)；h、i：E組織切片蘇木精-伊紅染色結(jié)果(4、100倍)；j、k、l：F組織切片熒光顯微鏡下觀察結(jié)果(100倍)

圖1 組織切片鏡下觀察結(jié)果

本研究選取了具有代表性的6種組織類型，含有鈦合金種植釘?shù)谋雀袢M骨組織在口腔醫(yī)學(xué)研究中是最為常見的組織，該類組織的骨成分復(fù)雜，種植釘較大；含有鈦合金直釘和螺紋種植釘?shù)男∈蠊晒窍鄬碇v骨組織較為單一，種植釘較??；含有多孔鈦材料的兔股骨踝骨是植入金屬球的組織代表[20-21]，該類組織制作切片時植入物與骨組織結(jié)合不牢固易脫出；含有鈷鉻支架的兔心血管組織是植入細(xì)小金屬支架的代表，該類組織是心腦血管研究中較為常見的組織類型；含有鈣黃綠素和茜素絡(luò)合物標(biāo)記的大鼠上腭組織是熒光素標(biāo)記的組織代表，組織中的熒光素在普通切片制作中易丟失[22]。

本研究的組織切片主要進(jìn)行了兩組染色，Ladewig染色對軟組織的著色更加明顯，軟組織呈黃色，骨組織呈藍(lán)色，并且可以清晰地顯示骨的疏密程度；蘇木精-伊紅染色是組織切片的常規(guī)染色方法，可以觀察骨組織基本結(jié)構(gòu)[23-26]。A和B組織切片經(jīng)染色后可見邊緣完整的黃色軟組織，藍(lán)色骨組織與種植釘結(jié)合緊密，螺紋邊緣也出現(xiàn)新生骨。C組織切片經(jīng)染色后可觀察到螺紋邊緣有大量新生骨，髓腔內(nèi)的疏松軟組織完整；D組織切片經(jīng)染色后可見鈦材料周圍有大量新生骨，顏色相對原生骨較淺，腔內(nèi)軟組織未脫落；E組織經(jīng)染色后可見支架，未發(fā)生位移和脫落，血管壁分層明顯。因此，對于外圍附著有軟組織及組分相對復(fù)雜的骨組織(如頜骨組織)可以選用Ladewig染色，組分相對單一的股骨、脛骨及血管等組織可以選用蘇木精-伊紅染色。

硬組織切片技術(shù)工藝復(fù)雜，制片流程環(huán)環(huán)相扣，稍有失誤則會影響后續(xù)制片，因此該技術(shù)在操作的過程中要注意以下問題：①組織固定浸潤操作過程中應(yīng)注意時間的把握。組織固定結(jié)束后流水充分沖洗[27-28]，將固定液洗凈，若有殘留固定液則會影響后期染色的效果，含有熒光素標(biāo)記的組織用體積分?jǐn)?shù)0.75的乙醇溶液固定，甲醛或多聚甲醛溶液會對熒光素產(chǎn)生破壞，從而影響結(jié)果分析；脫水浸潤時間要充足，若浸潤不完全，包埋過后組織內(nèi)部會出現(xiàn)大量空洞，或者出現(xiàn)組織外周硬中間軟的現(xiàn)象，制片過程中極易脫片，嚴(yán)重影響切片質(zhì)量。②組織包埋過程中注意避免出現(xiàn)氣泡。包埋前輕輕震蕩模具，將光固化樹脂內(nèi)部的氣泡振出，或?qū)⒛＞叻湃牍墙M織切片修復(fù)機(jī)內(nèi)抽真空1 h，將氣體抽出，若殘存大量氣泡，包埋結(jié)束后組織周邊會出現(xiàn)空洞，影響切片質(zhì)量。③組織切磨片過程中避免出現(xiàn)氣泡和劃痕。粘接載片時注意動作要慢要輕，避免產(chǎn)生氣泡，粘合劑7210應(yīng)適量，過多會從上載片溢出，損壞載片真空吸附裝置，過少會導(dǎo)致粘合不完全，邊緣翹起易脫片；磨片時按照砂礫由大到小逐級打磨，若打磨不充分，會產(chǎn)生大量黑色劃痕，影響觀察效果；打磨帶有金屬支架的血管組織時要低速慢磨，否則金屬材料極易從血管內(nèi)壁脫落[29-30]。④組織切片染色前應(yīng)注意載片清潔使染色更加美觀。含有熒光素的切片應(yīng)先在熒光顯微鏡下觀察發(fā)光情況并保存數(shù)據(jù)后再進(jìn)行染色，如果先行染色，染料會遮蓋熒光信號，鏡下觀察時模糊不清，嚴(yán)重影響熒光結(jié)果分析；切片染色前用軟毛刷清潔載片表面，清除磨片過程中粘附在載片上的雜質(zhì)顆粒，使染色清晰美觀，染色時盡量避免滴染，否則易造成著色不均勻，影響染色效果[31]。⑤封片時應(yīng)注意中性樹膠的用量，封好的切片應(yīng)注意保存。封片時中性樹膠不可滴加過多，否則切片不易干，蓋玻片與組織之間易滑動，影響觀察，封好的切片應(yīng)放置在陰涼通風(fēng)處，避免陽光直射，避免放在空調(diào)房等比較干燥的環(huán)境。

綜上所述，EXAKT硬組織切磨技術(shù)可將含有金屬植入物、骨粉、熒光標(biāo)記的各種軟硬組織制成高質(zhì)量的薄切片，切片厚度均勻，劃痕極少，穩(wěn)定性高，在顯微鏡下可清晰地觀察到軟硬組織形態(tài)及熒光標(biāo)記，經(jīng)各種染色后可進(jìn)行骨界面、骨愈合的定量分析，在骨科等組織形態(tài)研究領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。