羅秋紅,吳 俊,柏 斌,莊 文,姚棟萍,肖 貴,劉雄倫,鄧啟云,3

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院,湖南 長沙 410128；2.雜交水稻國家重點實驗室,湖南雜交水稻研究中心,湖南 長沙 410125；3. 湖南袁創(chuàng)超級稻技術有限公司,湖南 長沙 410323)

近年來溫室氣體大量排放,導致全球氣候變暖和極端高低溫天氣頻現(xiàn)。水稻是我國主要的糧食作物之一,是喜溫作物,對低溫環(huán)境敏感。世界很多水稻種植區(qū)均受到過冷害脅迫,我國東北水稻種植區(qū)、華南及長江中下游水稻種植區(qū)的晚稻容易遭受寒冷低溫脅迫,損害水稻的正常生長發(fā)育,降低水稻產(chǎn)量,造成巨大的產(chǎn)量損失[1]。相關研究表明,芽期溫度低于8 ℃將導致水稻成苗率明顯下降[2]。苗期低溫會影響水稻生長發(fā)育,進而降低水稻產(chǎn)量[3]。孕穗期是水稻育性敏感期,研究認為孕穗期持續(xù)低溫會造成水稻株高、穗長、結實率、千粒質(zhì)量降低,對產(chǎn)量造成顯著影響[4]。孕穗期冷水脅迫會造成抽穗期到成熟期干物質(zhì)積累減少,并影響有機物質(zhì)向不同部位的輸送[5]。當前已從產(chǎn)量構成[6]、激素[7]、穎花育性[8]等不同角度對孕穗期低溫脅迫進行了闡述,但仍未能明確水稻孕穗期受低溫脅迫影響的關鍵形態(tài)生理指標。

本試驗選取生產(chǎn)上大面積推廣的水稻品種,在孕穗分化Ⅴ期(育性敏感期[9])模擬低溫環(huán)境,17.5 ℃、10 d的低溫冷水灌溉處理,對受低溫影響后的功能葉和穎花的生理特征進行分析,以期比較不同水稻品種在孕穗期受低溫脅迫的形態(tài)生理差異,明確孕穗期受低溫脅迫影響的關鍵形態(tài)生理指標,為孕穗期耐低溫品種的選育提供理論指導。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗選取4個在生產(chǎn)上大面積推廣的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)水稻品種：秈型雜交稻Y兩優(yōu)957、秈型雜交稻天優(yōu)華占、秈型雜交稻Y兩優(yōu)1號、秈型常規(guī)稻中早39。

1.2 試驗方法

1.2.1 栽培措施與田間管理 試驗于2018年在湖南雜交水稻研究中心長沙馬坡嶺本部試驗田進行。按湖南地區(qū)常規(guī)方法播種育秧,從5月21日開始播種,每隔10 d所有材料重復播種一次,共播種3次。插秧的密度為23.3 cm×23.3 cm,每穴插單苗,移栽時間分別6月15日、6月20日、6月30日。試驗采取完全隨機設計,單個播種批次單個品種種植300蔸(10×30),試驗期間按中稻常規(guī)管理措施進行水分和病蟲害管理?？茖W施肥,采取常規(guī)高產(chǎn)栽培施肥方法[10],氮肥總用量為180 kg/hm2, 氮、磷、鉀配比為1.0∶0.6∶1.1?；手械伎偸┑康?0%,鉀占總施鉀量的40%,磷肥全作底肥；分蘗肥中氮占總施氮量的40%,鉀占總施鉀量的20%；穗肥中氮占總施氮量的30%,鉀占總施鉀量的40%,分促花肥(幼穗分化Ⅰ期) 和?；ǚ?幼穗分化Ⅳ期) 2次施用。

1.2.2 低溫處理 待大田種植各品種生長至幼穗分化敏感Ⅴ期,分別選擇主莖葉齡余數(shù)為0.9的植株各70株,移至35個塑料盆缽中,每盆2株水稻。隨機分為低溫處理組(CT,25盆)和對照組(CK,10盆),各播種批次重復處理1次,共處理3次。盆缽在自然條件下適應3 d后,將低溫處理組置于冷水灌溉池17.5 ℃低溫處理10 d,處理時期的光濕環(huán)境均為大田自然環(huán)境,10 d后,重新同對照組一起放置到自然條件下繼續(xù)生長至成熟。

1.2.3 測定項目及方法 葉綠素SPAD值：在低溫處理結束當天(第10天)用SPAD502測定劍葉SPAD值。每個品種選取長勢較為一致的水稻植株6株,測定葉片中部、中部上端3 cm和中部下端3 cm,取其平均值。

花粉育性及結實率：低溫處理組在低溫處理結束當天,人工標記幼穗分化敏感Ⅴ期受到10 d低溫脅迫的幼穗,此時水稻植株的葉枕距為-1～4 cm。對照組開花當日、低溫處理組標記穗開花當日,分別隨機選取3個已開花的幼穗,取中部未開花的穎花進行花粉鏡檢。用0.2% KI-I2溶液對花粉進行染色,在顯微鏡下觀察并拍照,人工統(tǒng)計不育花粉比率。

待各材料成熟后,低溫處理組隨機選取20個標記穗,對照組隨機選取20個成熟穗,人工數(shù)粒統(tǒng)計結實率,并計算冷害指數(shù)。冷害指數(shù)=(對照結實率-低溫處理結實率)/對照結實率。

抗氧化系統(tǒng)生理生化指標：低溫處理結束當天,分別取對照組與低溫處理組劍葉各5片；隨機選取水稻各一株取其處于幼穗分化幼穗Ⅵ和Ⅶ期的幼穗穎花,使用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(Elisa)試劑盒(上海優(yōu)選生物YX系列產(chǎn)品)測定劍葉的超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性以及穎花的超氧化物歧化酶(SOD)活性。

滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)生理生化指標：低溫處理結束當天,分別取對照組與低溫處理組劍葉5片；隨機選取水稻各一株取其處于幼穗分化幼穗Ⅵ和Ⅶ期的幼穗穎花,使用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(Elisa)試劑盒(上海優(yōu)選生物YX系列產(chǎn)品)測定劍葉的脯氨酸(PRO)、可溶性總糖(STS)、可溶性蛋白(sPRO)含量；同時利用該方法測定幼穗穎花的PRO和STS含量及蔗糖合成酶(SS)活性等生理指標。

ABA含量：低溫處理結束當天,隨機選取水稻各一株取其處于幼穗分化幼穗Ⅵ和Ⅶ期的幼穗穎花,收集足量后,-80 ℃冷凍保存,各樣品取3次重復。使用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(安捷倫1290高效液相色譜儀串聯(lián)AB公司Qtrap 6500質(zhì)譜儀),測定水稻幼穗穎花的內(nèi)源激素ABA含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2010軟件進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 孕穗期低溫脅迫對結實率的影響

結實率變化和冷害指數(shù)是水稻幼穗分化期受低溫脅迫影響程度的直觀表現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)孕穗期17.5 ℃、10 d低溫處理后,4個水稻品種的結實率均有所下降,其中天優(yōu)華占和Y兩優(yōu)957的結實率下降不顯著,Y兩優(yōu)1號、中早39的結實率均表現(xiàn)為顯著降低(表1)。因此,Y兩優(yōu)957和天優(yōu)華占可作為低溫耐受品種,Y兩優(yōu)1號和中早39可作為低溫敏感品種。

表1 孕穗期低溫對不同品種結實率的影響Tab.1 Effect of low temperature at booting stage on seed setting rate of different varieties

注：表中同行內(nèi)不同小寫字母表示不同處理之間差異達0.05顯著水平。表3-4同。

Note：Values followed by different small letters within a line are significantly different atP<0.05.The same as Tab.3-4.

2.2 孕穗期低溫脅迫對花粉育性的影響

在本研究中4個品種經(jīng)過10 d低溫處理后,不育花粉均比對照組增多(圖1)。中早39不育花粉比例最大(表2),Y兩優(yōu)1號次之。即低溫脅迫對中早39花粉育性影響最大,Y兩優(yōu)1號次之,對Y兩優(yōu)957和天優(yōu)華占影響較小,這與結實率結果一致,說明結實率降低的重要原因之一是花粉育性下降。

2.3 孕穗期低溫脅迫對劍葉SPAD值的影響

SPAD值可以衡量葉片葉綠素的相對含量[11]。在低溫脅迫10 d后測定劍葉SPAD值發(fā)現(xiàn),除低溫耐受品種天優(yōu)華占外,其他3個品種低溫處理后劍葉的SPAD值均顯著低于對照組(表3)。表明低溫脅迫影響了水稻劍葉的光合作用,但SPAD值的顯著下降與結實率的顯著降低并不完全一致。

2.4 孕穗期低溫脅迫對劍葉與穎花抗氧化系統(tǒng)酶活性的影響

低溫脅迫會破壞植物細胞膜的結構,改變膜的透性、積累活性氧,破壞蛋白質(zhì)、核酸等生物功能分子,引起代謝紊亂,影響正常的光合作用。植物組織中的SOD、CAT、POD可以清除活性氧,可作為衡量植物抗冷能力的指標[12]。低溫脅迫后測定各品種劍葉與穎花抗氧化系統(tǒng)酶活性后發(fā)現(xiàn)：低溫脅迫后,低溫耐受品種Y兩優(yōu)957、天優(yōu)華占劍葉SOD、CAT活性均顯著高于對照,劍葉POD活性上升,天優(yōu)華占上升達顯著水平；而低溫敏感品種則呈現(xiàn)出相反的趨勢,劍葉SOD、POD活性低于對照,其中Y兩優(yōu)1號劍葉SOD活性顯著下降,Y兩優(yōu)1號和中早39的POD活性降幅均達到顯著水平； Y兩優(yōu)1號和中早39的劍葉CAT活性與低溫耐受品種表現(xiàn)一致,均比對照高；穎花的SOD活性與劍葉的SOD活性變化相反,低溫耐受品種穎花SOD活性顯著低于對照,低溫敏感品種穎花SOD活性顯著高于對照(圖2)。

A，B. Y兩優(yōu)957 CK、CT組；C，D. 天優(yōu)華占CK、CT組； E，F(xiàn). Y兩優(yōu)1號CK、CT組； G，H. 中早39 CK、CT組。比例尺：100 μm。 A，B. Yliangyou 957 CK, CT treatment; C，D. Tianyouhuazhan CK, CT treatment; E，F(xiàn). Yliangyou 1 CK, CT treatment; G，H. Zhongzao 39 CK, CT treatment.Scale bar：100 μm.

表2 孕穗期低溫對不同品種花粉育性的影響Tab.2 Effect of low temperature at booting stage on pollen fertility of different varieties

表3 孕穗期低溫對不同品種葉綠素SPAD值的影響Tab.3 Effect of low temperature at booting stage on SPAD value of different varieties

2.5 孕穗期低溫脅迫對劍葉與穎花滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

圖中不同小寫字母表示不同處理之間差異達0.05顯著水平。圖3同。Different small letters indicate significance between different treatments at P<0.05. The same as Fig.3.

植物細胞在遭受逆境后,會積累脯氨酸(PRO)、可溶性糖(STS)、可溶性蛋白(sPRO)等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),以增強細胞的持水能力[13],且許多參與代謝調(diào)節(jié)的酶均以可溶性蛋白的形式存在[14]。糖是主要的光合作用產(chǎn)物可合成淀粉等有機大分子,也是調(diào)節(jié)源庫關系的重要信號分子[8]。綜上所述,PRO、STS和sPRO含量及蔗糖合成酶(SS)活性均可用于衡量植物對于逆境的反應程度。

由圖3-A可知,Y兩優(yōu)957、Y兩優(yōu)1號、中早39低溫處理后劍葉PRO含量均高于對照,且中早39顯著高于對照,天優(yōu)華占低溫處理后劍葉PRO含量顯著低于對照。圖3-B中,Y兩優(yōu)957、Y兩優(yōu)1號、天優(yōu)華占低溫處理后劍葉STS含量均高于對照,其中Y兩優(yōu)957、Y兩優(yōu)1號顯著高于對照,中早39低溫處理后劍葉STS含量較對照稍有下降。圖3-C中,Y兩優(yōu)957低溫處理后劍葉sPRO含量與對照相比變化不大,天優(yōu)華占sPRO含量顯著高于對照,Y兩優(yōu)1號、中早39的sPRO含量顯著低于對照。

圖3-D中可以看出,Y兩優(yōu)957、天優(yōu)華占、中早39的穎花低溫處理后其PRO含量均顯著低于對照,而Y兩優(yōu)1號低溫處理后穎花PRO含量顯著高于對照。圖3-E中,低溫耐受品種Y兩優(yōu)957、天優(yōu)華占低溫處理后穎花STS含量顯著低于對照；低溫敏感材料Y兩優(yōu)1號、中早39的低溫處理后穎花STS含量高于對照,且Y兩優(yōu)1號增幅顯著。圖3-F中,Y兩優(yōu)957、中早39低溫處理后穎花的蔗糖合成酶(SS)活性低于對照,中早39降幅達到顯著水平；天優(yōu)華占和Y兩優(yōu)1號低溫處理后穎花的SS活性均顯著高于對照。

圖3 幼穗分化敏感期低溫對不同品種滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)的影響Fig.3 Effect of low temperature at booting stage on osmotic adjustment of different varieties

2.6 孕穗期低溫脅迫對穎花ABA含量的影響

脫落酸(ABA)是調(diào)節(jié)非生物脅迫的重要激素,能誘導冷調(diào)控基因的表達[15],增強植物的抗寒能力。本試驗分別選取低溫耐受品種Y兩優(yōu)957和低溫敏感品種中早39的穎花為試驗材料,分析低溫處理10 d后其穎花的ABA含量變化。從表4中可以看出,低溫處理后,低溫耐受品種Y兩優(yōu)957和低溫敏感品種中早39的穎花ABA含量均顯著高于對照。

表4 孕穗期低溫對穎花ABA含量的影響Tab.4 Effect of low temperature at booting stage on ABA content ng/g

3 討論

3.1 孕穗期低溫對劍葉生理指標的影響

孕穗期低溫會導致膜脂過氧化、積累活性氧[12],影響劍葉的光合作用[16]。在本試驗中,4個品種劍葉SPAD值均較對照組低,表明低溫處理會影響劍葉的光合作用,且在品種間存在差異?？寡趸到y(tǒng)能夠有效地清除自由基,有利于保障植物組織的正常功能。在本研究中,低溫耐受品種Y兩優(yōu)957、天優(yōu)華占的劍葉SOD、POD、CAT活性上升,表明這2個品種在遭受逆境后抗氧化系統(tǒng)增強,減輕了細胞膜的受損,葉片作為能量源仍能提供足量的同化產(chǎn)物,減輕了低溫脅迫對水稻穎花發(fā)育的影響；而低溫敏感品種Y兩優(yōu)1號、中早39劍葉的SOD、POD活性低于對照,影響了劍葉正常提供足量的同化產(chǎn)物,導致水稻穎花發(fā)育不足；低溫處理后4個品種的CAT活性均有所上升,與SOD和POD活性表現(xiàn)不同,說明不同抗氧化酶參與低溫調(diào)控的作用和機理可能不同。

目前脯氨酸功能尚未完全明確,一般認為脯氨酸是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),是合成蛋白質(zhì)的原料[17]。低溫耐受品種天優(yōu)華占PRO含量在低溫脅迫下顯著低于對照,低溫敏感品種中早39低溫脅迫后PRO含量顯著上升。前人研究發(fā)現(xiàn)脯氨酸含量的上升能提高馬鈴薯和小麥的耐低溫能力,但在擬南芥中一些耐冷材料與敏感材料在低溫脅迫后積累的脯氨酸含量都比較低[18]。在水稻三葉期的研究結果表明，敏感品種在低溫、干旱、鹽脅迫下會積累更多脯氨酸[19],說明脯氨酸含量與植物抗寒性并不呈正相關。對比4個品種劍葉的PRO含量與sPRO含量發(fā)現(xiàn),二者變化趨勢基本相反。白志英等[20]同樣發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下,小麥孕穗期、開花期、灌漿期劍葉PRO含量與sPRO含量呈現(xiàn)負相關。而這一現(xiàn)象可能是可溶性蛋白在非生物脅迫下被分解形成了脯氨酸導致的,還需進一步設計試驗進行驗證。低溫敏感品種與低溫耐受品種在sPRO含量上的差異表現(xiàn)表明，可溶性蛋白可能有利于植物抵抗低溫逆境。除中早39外的3個品種劍葉的可溶性總糖含量均比對照組高,其中低溫敏感品種Y兩優(yōu)1號低溫處理組與對照組差異最大,表明劍葉可溶性糖STS含量與抗寒性并不呈現(xiàn)正相關。而前人在粳稻中研究發(fā)現(xiàn)不同品種在分蘗期、孕穗期、灌漿期低溫脅迫后,可溶性糖含量的變化與耐冷性呈現(xiàn)正相關[21],與本試驗的結果不同,推測可能存在秈粳亞種間的差異。

3.2 孕穗期低溫對幼穗穎花生理及育性的影響

孕穗期持續(xù)低溫會導致結實率降低,且在不同品種間存在差異。本研究結合花粉鏡檢的結果可知結實率降低重要原因之一是由于花粉不育造成的,這一結論與前人研究結果相同[22]。SOD酶活性降低會影響活性氧的清除,但低溫耐受品種低溫處理后穎花的SOD酶活性顯著低于對照,低溫敏感品種則顯著高于對照。低溫脅迫處理后水稻劍葉和穎花SOD活性的變化呈現(xiàn)相反的趨勢,PRO、STS含量也表現(xiàn)為這種趨勢,低溫耐受品種受低溫脅迫后穎花PRO、STS含量顯著低于對照。表明幼穗與劍葉在低溫脅迫下的生理響應不一致,推測這些抗氧化酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在水稻植株上保持一個整體的平衡,外部環(huán)境刺激會導致物質(zhì)在植物不同部位分布,從而影響植物整體的生長發(fā)育情況,這有待于進一步的試驗驗證。ABA 可以調(diào)控絨氈層內(nèi)發(fā)的細胞死亡,是目前研究最清楚的參與低溫脅迫信號轉導的激素。本研究中低溫脅迫后ABA含量顯著高于對照。前人研究發(fā)現(xiàn)孕穗期低溫脅迫后水稻葉片ABA含量上升,與本試驗研究結果相似[23]。ABA可以傳導脅迫信號,因此在逆境下會迅速增加ABA含量以抵御逆境傷害[13, 24]。

前人研究中多以劍葉生理指標作為耐冷指標[21],對小穗研究多集中于花藥開裂、花粉萌發(fā)等方面,生理指標的研究較少涉及,本試驗同時分析水稻劍葉和穎花在幼穗分化期受低溫脅迫后的生理調(diào)控機理,發(fā)現(xiàn)SOD、PRO、STS等多個生理指標在劍葉和穎花中的表現(xiàn)不一致甚至相反,可能存在源庫受外部環(huán)境影響后的一個動態(tài)平衡機制,該研究為孕穗期低溫脅迫對水稻生理特征的影響提供了新的思路。