周超 王刊石 趙磊

(江南大學(xué)附屬醫(yī)院(無錫三院)骨科，江蘇 無錫 214041)

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎作為一種嚴(yán)重?fù)p傷膝關(guān)節(jié)功能的退行性疾病，多伴隨有軟骨下骨質(zhì)增生，易發(fā)于中老年群體，通常表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)處疼痛難忍、上下樓梯吃力，嚴(yán)重者膝關(guān)節(jié)處會出現(xiàn)腫脹而無法行動，極大地影響患者生活質(zhì)量〔1,2〕。整合素(ITG)屬于細(xì)胞黏附分子家族的一種異二聚體跨膜蛋白，主要由α和β兩個亞單位組成，其αv亞基與不同的β亞基結(jié)合后可作為玻連蛋白及纖連蛋白的受體，在細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基礎(chǔ)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮雙向作用，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)移、黏附等進(jìn)程〔3,4〕。既往研究發(fā)現(xiàn)，ITGα5β1在早期發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良動物模型中表達(dá)水平與髖臼軟骨的退變程度顯著相關(guān)〔5〕，ITGαvβ3作為與ITGα5β1功能相似的家族成員，其在骨性關(guān)節(jié)炎不同退變程度關(guān)節(jié)軟骨中表達(dá)差異性的相關(guān)研究較少，因此本研究利用全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)得到的不同退變程度關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本作為研究對象，來分析關(guān)節(jié)軟骨中ITGαvβ3表達(dá)水平與老年膝骨關(guān)節(jié)炎退變程度的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本樣本來源 回顧性分析江南大學(xué)附屬醫(yī)院(無錫三院)2016年1月至2018年12月收治的20例老年膝骨關(guān)節(jié)炎行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者，均符合中華醫(yī)學(xué)會骨科分會2007年修訂的膝骨關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)〔6〕。關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本來源于全膝關(guān)節(jié)置換中股骨內(nèi)外踝負(fù)重面軟骨，根據(jù)Outerbridge分級標(biāo)準(zhǔn)〔7〕利用鋒利的手術(shù)刀選擇不同退變程度的軟骨標(biāo)本71例，均分為3塊，1塊用中性甲醛固定進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色觀察，其余2份用液氮迅速冷凍后保存于-80℃超低溫冰箱待測。

1.2主要試劑 ITGαv、ITGβ3、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP-13引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(購自賽默飛世爾科技公司)；兔抗人ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13、GAPDH抗體(購于Cell signaling technology)。

1.3標(biāo)本分組 根據(jù)HE染色結(jié)果，參考Mankin評分標(biāo)準(zhǔn)將所有標(biāo)本分為正常組、輕度退變組、中度退變組、重度退變組。正常組0分(5例)；輕度退變組1～6分(23例)；中度退變組7～9分(24例)；重度退變組10～14分(19例)。

1.4qRT-PCR檢測 取軟骨組織標(biāo)本50 μg，按照總RNA提取試劑盒說明書上操作步驟提取總RNA，提取后用紫外分光光度計檢驗，OD值(A260/A280)=1.8～2.0，并用凝膠電泳檢測RNA的完整性。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成。反轉(zhuǎn)錄體系(10 μl)：2×miRNA反應(yīng)混合液5 μl，0.1 % BSA 1 μl，miRNA PrimeScript? RT酶混合物1 μl，總RNA 0.5 μl，去RNA酶雙蒸水(ddH2O)2.5 μl。反應(yīng)條件設(shè)置：37℃ 60 min，85℃ 5 s，4℃ 30 min。PCR體系10 μl：SYBR?Prmix Ex Tap Ⅱ(2×)5 μl，上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，ROX熒光參比染料(50×)0.2 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 3 μl。具體操作見試劑盒說明書。PCR參數(shù)設(shè)置：50℃激活聚合酶5 min，95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火和延伸34 s，反應(yīng)進(jìn)行40個循環(huán)。每個樣孔設(shè)置3個復(fù)孔。引物信息見表1。用2-△△Ct法計算mRNA的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.5Western印跡檢測 取關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本200 μg，用蛋白裂解液提取總蛋白質(zhì)，調(diào)整各組蛋白濃度一致后，經(jīng)十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、電轉(zhuǎn)膜至甲醛處理過預(yù)處理過的聚偏氟乙烯(PVDF)膜，密封2 h，加入兔抗人ITGαvβ3(1∶500)、MMP-9(1∶500)、MMP-13(1∶500)、GAPDH抗體(1∶1 000)一抗4℃孵育過夜，TBST漂洗40 min，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶500)孵育1 h，TBST漂洗40 min，電化學(xué)發(fā)光(ECL)液將PVDF膜顯色，暗室曝光到X線片上，采用Imaging System軟件分析各組條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參積分吸光度值比值表示蛋白的相對表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1不同退變程度關(guān)節(jié)軟骨中ITGαv、ITGβ3、MMP-9、MMP-13的mRNA相對表達(dá)水平 ITGαv、ITGβ3、MMP-9、MMP-13的表達(dá)水平在膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中存在差異性表達(dá)，并且隨著關(guān)節(jié)軟骨退變程度增加其表達(dá)水平明顯升高，組間相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.2不同退變程度關(guān)節(jié)軟骨中ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表達(dá)水平 ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表達(dá)水平在膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中存在差異性表達(dá)，并且隨著關(guān)節(jié)軟骨退變程度增加其表達(dá)水平明顯升高，組間相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3，圖1。

2.3ITGαvβ3蛋白表達(dá)與MMP-9、MMP-13蛋白表達(dá)水平相關(guān)性分析 ITGαvβ3蛋白表達(dá)水平與MMP-9、MMP-13蛋白表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(P<0.001)；MMP-9蛋白表達(dá)水平與MMP-13蛋白表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(P<0.001)。見圖2。

表2 不同退變程度關(guān)節(jié)軟骨中ITGαv、ITGβ3、MMP-9、MMP-13 mRNA相對表達(dá)情況

與正常組相比：1)P<0.05；與輕度退變組相比：2)P<0.05；與中度退變組相比：3)P<0.05；下表同

2.4ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表達(dá)水平與關(guān)節(jié)軟骨退變程度相關(guān)性分析 ITGαvβ3、MMP-9及MMP-13蛋白表達(dá)水平均與關(guān)節(jié)軟骨退變程度呈顯著正相關(guān)(P<0.001)。見圖3。

表3 不同退變程度關(guān)節(jié)軟骨中ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表達(dá)水平

1：正常組；2：輕度退變組；3：中度退變組；4：重度退變組圖1 不同退變程度關(guān)節(jié)軟骨中ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表達(dá)

圖2 ITGαvβ3蛋白表達(dá)與MMP-9、MMP-13蛋白表達(dá)水平相關(guān)性

橫坐標(biāo)1.正常，2.輕度退變，3.中度退變，4.重度退變圖3 ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表達(dá)水平與關(guān)節(jié)軟骨退變程度相關(guān)性

3 討 論

骨關(guān)節(jié)炎作為人類較為常見的一種退行性疾病，在發(fā)病過程中可觀察到相關(guān)組織結(jié)構(gòu)上的顯著變化，這些變化與力學(xué)、生物學(xué)、遺傳基因、免疫、代謝等因素關(guān)系密切〔8〕。目前研究認(rèn)為骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展是軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及軟骨下骨降解合成耦聯(lián)失衡引起的〔9〕。ITG作為關(guān)節(jié)軟骨表面的機(jī)械敏感受體，主要發(fā)揮著介導(dǎo)胞外信號向胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)換的作用，當(dāng)受到各種應(yīng)力刺激后，能夠通過抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解、增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成、抑制軟骨細(xì)胞凋亡等方式來介導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)作用〔10,11〕。有研究表明，在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中ITG的β1亞基及所有類型的α亞基均會被表達(dá)來參與多種形式的外界應(yīng)力刺激〔12〕。本研究選用了膝骨關(guān)節(jié)炎行置換術(shù)后的關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本，并根據(jù)Outerbridge分級和HE染色結(jié)果分為了不同退變程度組別，對ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13的mRNA相對表達(dá)水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，和正常關(guān)節(jié)軟骨相比，不同退變程度關(guān)節(jié)軟骨中的ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13表達(dá)存在明顯差異，并且退變程度越嚴(yán)重表達(dá)水平越高，ITGαvβ3在正常軟骨細(xì)胞中受到應(yīng)力刺激時與白細(xì)胞介素(IL)-4表面受體形成異源二聚體，并通過Junus蛋白酪氨酸激酶(JAK)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白(STAT)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來發(fā)揮保護(hù)軟骨的作用〔13〕，但是骨關(guān)節(jié)炎病理狀態(tài)是則會在細(xì)胞外基質(zhì)中降解的纖維蛋白碎片刺激下，激活蛋白激酶(PKC)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)，來促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解關(guān)鍵蛋白MMP-9、MMP-13合成增加，加重軟骨細(xì)胞損傷，加速軟骨退化〔14〕。對不同退變程度關(guān)節(jié)軟骨中ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表達(dá)水平的分析發(fā)現(xiàn)，與mRNA相對表達(dá)水平一致，軟骨退變程度越嚴(yán)重中ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表達(dá)水平越高。

ITGαvβ3作為骨橋蛋白(OPN)的主要受體，由于OPN分子內(nèi)特異性及高度保守的RGD序列存在，能夠和ITGαvβ3結(jié)合后，激活FAK/Src復(fù)合物及下游Ras-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，改變細(xì)胞骨架還能夠促進(jìn)腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1、IL-6等炎性細(xì)胞因子水平表達(dá)，加重炎性反應(yīng)，對軟骨組織造成持續(xù)性傷害〔15〕。MMPs在調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要的作用，是機(jī)體生理重建和病理破壞的主要基礎(chǔ)因素之一，在骨性關(guān)節(jié)炎病理狀態(tài)下，MMPs大量合成與MMP抑制劑(TIMP)間的平衡被打破，關(guān)節(jié)軟骨的主要成分Ⅱ型膠原在MMP-13的作用下大量降解，膠原網(wǎng)被破壞，軟骨細(xì)胞將暴露在炎性因子的攻擊下，引起凋亡，最終引起軟骨退行性損傷〔16,17〕。本次研究對ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表達(dá)水平之間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13表達(dá)水平對于關(guān)節(jié)軟骨的退變程度均有一定的診斷價值。

綜上所述，ITG作為軟骨細(xì)胞中重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在骨性關(guān)節(jié)炎中的相關(guān)研究是目前的熱點方向之一，本研究的ITGαvβ3作為IGT眾多亞型之一，與關(guān)節(jié)軟骨的退變程度之間呈顯著正相關(guān)，并且還與MMP-9和MMP-13之間也呈顯著正相關(guān)，但I(xiàn)TGαvβ3參與骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生進(jìn)展的具體作用機(jī)制仍不清楚，還需要進(jìn)一步深入研究。