張 軍,鄭向前,高 明*

(1.天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院 乳腺二科，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，乳腺癌防治教育部重點實驗室，天津300060;2.天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院 甲狀腺頸部腫瘤科，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津300060)

腫瘤學研究包括發(fā)現(xiàn)新的抑癌基因并探討抑癌基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制。染色體脆性位點(fragile site)是正?；蚪M中位點特異的不穩(wěn)定區(qū)域，包括稀有型脆性位點(rare fragile site)和普通型脆性位點(common fragile site,CFS)，稀有型脆性位點與腫瘤的關系并不明確，然而普通型脆性位點與多種腫瘤基因組變異位點相一致，它們與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。但是由于缺少鑒定CFS的方法，其生物學功能以及作用機制仍不清楚。進化上保守的CFS與腫瘤發(fā)生密切相關，發(fā)現(xiàn)并闡明CFS基因生理功能以及調控機制，對于推動癌癥病因學，腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究，以及腫瘤分子診斷和風險預測具有重要意義，本文對染色體脆性位點以及全新普通型脆性位點基因 FATS(fragile-site associated tumor suppressor)的研究進展進行綜述。

1 染色體脆性位點(fragile site)

1.1 染色體脆性位點

染色體脆性位點(fragile site)包括39個稀有型脆性位點(rare fragile site)和88個普通型脆性位點(common fragile site,CFS)[1,2]。1984年普通型脆性位點被發(fā)現(xiàn)[3]，當受到某些因素的作用時DNA復制被抑制，染色體會在有絲分裂中期形成缺口或斷裂區(qū)。葉酸可以誘導稀有型脆性位點的出現(xiàn)，但是僅在少數(shù)人群(小于2.5%)的基因組發(fā)生，其與三核苷酸重復序列的擴增有關 (例如FA RXA 基因CCG重復擴增導致脆性X-染色體綜合癥)，稀有型脆性位點與癌癥無相關性。與稀有脆性位點不同，CFS可以在所有個體的染色體基因組中被誘導[1]；CFS進化上保守[2,4]，研究熱度越來越高主要有兩個原因：首先，導致CFS形成的因子和條件可以被鑒定；其次，CFS與腫瘤(包括癌基因)中的周期性染色體重排相關聯(lián)，CFS可能是導致染色體重排的重要原因[5]，是腫瘤發(fā)生或腫瘤進展的驅動因素[6]。Casper等[4]研究表明：ATR是參與DNA損傷反應信號傳導的細胞周期節(jié)點蛋白，ATR激酶調控CFS位點的穩(wěn)定性，但是同樣參與DNA損傷反應信號傳導的細胞周期節(jié)點蛋白ATM卻不參與CFS穩(wěn)定性的調控，提示DNA損傷反應信號傳導通路與CFS區(qū)域的基因組穩(wěn)定性可能存在著錯中復雜的關系；近年來，研究發(fā)現(xiàn)CFS經常位于DNA遲復制區(qū)，一個普通型脆性位點FAR3B順序遲復制，在誘導劑處理后在G2期中仍有16.5% FRA3B順序未被復制，因此脆性位點遲復制DNA對復制抑制劑的進一步抑制效應特別敏感[7]。CFS的特點之一是富含AT二核苷酸的重復序列，從而使DNA扭曲可變性增大[8,9]，大都與染色體DNA缺失相關的腫瘤發(fā)生相關[10,11]。

1.2 染色體脆性位點與腫瘤

許多研究已經證明CFS與腫瘤發(fā)生的相關性[7,12-17]，在腫瘤中需要逐個研究CFS中缺失的基因，從而探討CFS與在腫瘤中的作用機制。抑癌基因的研究目前已經成為腫瘤學研究的熱點，發(fā)現(xiàn)新的抑癌基因并證明其與細胞惡性轉化的作用及機制已成為腫瘤發(fā)生學的重要內容。在惡性腫瘤中CFS基因出現(xiàn)缺失，提示CFS基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能具有重要的生理功能。FHIT(一種二核苷三磷酸酶)，WWOX(一種氧化還原酶)和其他幾種CFS相關基因已被確認為抑癌基因，大多數(shù)關于CFS基因的功能研究也集中在FHIT和WWOX，它們的缺失可能導致腫瘤發(fā)展[11,18]。研究表明這些基因的缺失和/或表達降低是多種腫瘤預后不良的預測因子，有許多關于基因組改變和癌前病變中蛋白質表達缺失的報道，表明腫瘤抑制作用始于癌癥發(fā)展的早期階段[19,20]。FHIT表達的缺失是通過啟動子甲基化和/或缺失造成的，這種缺失機制與多種腫瘤的進展和存活率的降低相關[20-22]。WWOX基因純合子和半合子缺失在多種腫瘤出現(xiàn)，并且在人類的多種腫瘤中都有WWOX滅活，實驗證明WWOX缺失的小鼠29%自發(fā)生瘤，WWOX缺失加化學致癌物誘導可使動物的發(fā)病率高達96%，其中27%具有侵襲性[18,23]。最近，PARK2將它們與培養(yǎng)細胞和小鼠癌癥模型中的DNA損傷反應聯(lián)系起來[11]。據(jù)報道，F(xiàn)HIT的缺失導致dNTP失衡和自發(fā)復制應激[24]，并且WWOX在ATR介導的DNA損傷檢查點應答激活中起關鍵作用[25]。與這些假設一致，F(xiàn)hit和Wwox缺陷小鼠都表現(xiàn)出腫瘤發(fā)病率增加和對致癌物誘發(fā)的腫瘤的易感性的升高[26,27]。在缺失WWOX的腫瘤細胞中異位表達的WWOX可以抑制免疫受損小鼠中的細胞和腫瘤生長，同時缺失WWOX的小鼠中骨肉瘤，肺和乳腺癌的發(fā)生率更高[28]。但是FHIT和WWOX在DNA損傷反應中的作用機制并不完全清楚。

CFS發(fā)現(xiàn)已有三十多年的歷史[1,2,15,29]，但是由于缺少鑒定CFS的方法，CFS的研究出現(xiàn)瓶頸，其生物學功能以及作用機制仍不清楚。近年來，有學者發(fā)現(xiàn)在 CFS區(qū)域分布著一些microRNA，并且這些microRNA與腫瘤發(fā)生和預后有一定的關系[30,31]，但卻沒有足夠的證據(jù)其表明是否與染色體脆性位點相關，microRNA與染色體脆性位點的關系及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的意義仍有待進一步研究。因此尋找并確定CFS位點新基因并闡明其生物學行為，研究其對腫瘤的調控機制以及臨床轉化研究具有重要意義，并有可能應用于腫瘤的分子診斷和風險預測。

2 FATS (fragile-site associated tumor suppressor)基因

2.1 FATS基因的發(fā)現(xiàn)

用p53雜合子近交系C57BL/6J小鼠建立自發(fā)淋巴瘤模型，由于γ-射線輻射顯著增加p53缺陷小鼠的致瘤率，對5周齡實驗組p53雜合子小鼠實施一次單劑量(4Gy)γ-射線照射，同時建立小鼠誘發(fā)淋巴瘤模型[32,33]。6-12個月后，收集并提取小鼠腫瘤的基因組DNA，對照組提取未經照射處理的正常p53雜合子小鼠基因組DNA。利用覆蓋95%以上小鼠基因組的BAC微陣列DNA芯片，對32個自發(fā)淋巴瘤DNA樣品和29個DNA損傷誘發(fā)淋巴瘤DNA樣品進一步利用微陣列比較基因組雜交Array-CGH(microarray comparative genomic hybridization，Array-CGH)分析，掌握小鼠腫瘤全基因組缺失或擴增圖譜，分辨率為200kb。根據(jù)普通型脆性位點基因在進化上的保守性，著重分析在DNA損傷誘發(fā)淋巴瘤中的染色體缺失區(qū)域，結合生物信息學研究，確定在某些高頻缺失區(qū)域存在一些已知的抑癌基因(例如TCR?， p63等)，證明所獲得的小鼠誘發(fā)淋巴瘤基因組圖譜的可靠性和真實性。我們進一步發(fā)現(xiàn)在小鼠第七號染色體末端有一個缺失頻率很高的區(qū)域(約200kb)，這個區(qū)域在小鼠誘發(fā)淋巴瘤的缺失頻率比在自發(fā)淋巴瘤中高6倍，而且DNA序列分析顯示在這個對DNA損傷敏感的區(qū)域存在一個未被國際同行研究過的新基因我們將其命名為FATS(fragile-site associated tumor suppressor)。對小鼠誘發(fā)淋巴瘤第七號染色體的Array-CGH 圖譜，箭頭所指處的高頻缺失區(qū)域進一步進行生物信息學研究表明：這一區(qū)域在DNA損傷誘發(fā)淋巴瘤 (IR+)中的缺失頻率為70% (n=29)，但在自發(fā)淋巴瘤(IR-)中的缺失頻率下降為10% (n=32)。高頻缺失區(qū)域對應BAC克隆為RP23-35I7。人類FATS基因結構以及在10號染色體脆性位點FRA10F的定位。紅色熒光原位雜交信號顯示探針BAC克隆RP11-179O22。FRA10F在正常人細胞中的出現(xiàn)頻率小于1%[34](圖1)。這驗證了Array CGH技術應用于DNA損傷誘發(fā)小鼠腫瘤模型是發(fā)現(xiàn)CFS基因的新途徑。

A.利用比較基因組雜交(CGH)技術,對遺傳背景一致的p53(+/-)小鼠淋巴瘤進行全基因組掃描分析 B.腫瘤基因組7號染色體基因拷貝數(shù)擴增及缺失的代表性圖譜。FATS基因位于近端粒區(qū)的一個顯著缺失位點(箭頭所指處) C.FATS基因結構示意圖：生物信息學分析結果表明：該基因最大編碼外顯子區(qū)(編碼N端363個氨基酸殘基)在腫瘤中的缺失頻率很高,并且對DNA損傷極其敏感,具有統(tǒng)計學意義(P<0.001,n=29)。IR：離子輻射

圖1 FATS新基因的發(fā)現(xiàn)

2.2 FATS基因與腫瘤的基礎研究

FATS 基因的內含子和表達調控區(qū)含有豐富的AT重復序列，具有典型的脆性位點基因特征。FATS是本課題組在國際上首先發(fā)現(xiàn)的與DNA損傷誘發(fā)腫瘤相關的抑癌基因，定位于10q26.2，熒光原位雜交(FISH)實驗證實FATS位于染色體脆性位點FRA10F上[34]。由于多種腫瘤在這一位點出現(xiàn)雜合子丟失(loss of heterozygosity,LOH)，因此FATS基因可能與人類腫瘤的發(fā)生有著密切的關系。進一步發(fā)現(xiàn)， FATS 基因不僅在乳腺癌、卵巢癌、肺癌患者DNA中存在顯著的缺失， RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)在與相應正常細胞和癌旁組織比較FATS mRNA表達水平在多種癌細胞和腫瘤組織中出現(xiàn)降低甚至不表達，將 FATS 表達載體共轉染細胞后，呈現(xiàn)明顯的體外(in vitro)和體內(in vivo)抗腫瘤活性[35]。FATS 基因是如何抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制已經取得重要進展，研究發(fā)現(xiàn)FATS基因的表達能顯著誘導p21的蛋白表達量，p21是調控細胞周期的重要的抑制性因子，從而使細胞周期阻滯于G1期[34]。使用射線或者藥物誘導DNA損傷，F(xiàn)ATS可以更加有效的使細胞周期阻滯于G1期。在MEF細胞中應用FATS- siRNA抑制FATS 基因表達，同時誘導DNA損傷，發(fā)現(xiàn)細胞進入有絲分裂期的比例增高，提示G2/M細胞周期節(jié)點(checkpoint)功能受損[34]。應用熒光顯微鏡，發(fā)現(xiàn)在DNA誘導損傷和 抑制FATS 表達后，進入M期的細胞存在嚴重的胞質分裂缺陷、并影響細胞有絲分裂中著絲粒(centrosome)的正常分布，表明 FATS 基因表達對維持基因組穩(wěn)定性(genomic stability)有重要影響[35]。

FATS 是一個有重要生物學功能的腫瘤分子標記物，初步研究證實：FATS 通過與組蛋白去乙?；窰DAC1發(fā)生蛋白質相互作用，抑制HDAC1對p21蛋白的去乙?；黾蛹毎麅萷21蛋白的穩(wěn)定性和豐度，對維持基因組穩(wěn)定性有重要作用[34]。雖然FATS在轉錄水平受p53抑癌基因的調控，但在p53失活后 FATS 表達仍具有抗腫瘤活性[35]。由于 FATS 基因在DNA損傷誘發(fā)的腫瘤中缺失頻率增加與p53雜合型缺失的遺傳背景有關，而且p53對DNA損傷修復有重要調控作用[36],進一步推測 FATS 對p53的表達可能有影響。為驗證這一實驗假說，首先將 FATS 表達載體共轉染，免疫印跡實驗結果顯示 FATS 基因表達可顯著誘導細胞內p53蛋白的表達水平增高。用小分子RNA抑制 FATS mRNA 的表達，細胞中p53蛋白表達水平隨之下降，提示 FATS 基因的表達對于維持p53蛋白表達水平是必需的。這些初步研究結果提示 FATS 和p53這兩個抑癌基因之間存在相互調控關系，即：FATS 基因的轉錄受p53調控[35]， FATS 基因的表達反過來又提高p53的蛋白表達水平[37]。對FATS功能在細胞水平上的基礎性研究證實：FATS參與DNA損傷反應和細胞周期調控，F(xiàn)ATS蛋白 N-端(67-175)區(qū)域直接結合組蛋白去乙?；?(HDAC1)、增強細胞周期負調控因子p21的乙?；揎?，進而抑制蛋白酶體C8亞單位與p21蛋白C-端的結合和蛋白酶體對p21的直接降解[34]。通過篩選小鼠睪丸cDNA文庫，本實驗室在國際上首次發(fā)現(xiàn)一個FATS mRNA剪接異構體(GenBank 收錄號GQ499374)，以此確定FATS啟動子區(qū)序列,并證實FATS在轉錄水平受p53激活[35]。最新的研究成果表明FATS蛋白的N端(1-67)區(qū)域與p53蛋白發(fā)生直接相互作用，F(xiàn)ATS表達能增強p53蛋白的表達水平[38]。進一步發(fā)現(xiàn)FATS是一個獨特的不依賴于泛素結合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,E2)的泛素連接酶(ubiquitin ligase,E3)。與以往發(fā)現(xiàn)的E3不同，F(xiàn)ATS對p53的多聚泛素化修飾并不導致p53降解，相反，F(xiàn)ATS增強p53蛋白的轉錄因子活性和穩(wěn)定性。體外泛素化實驗結果證實：FATS對p53的多聚泛素化修飾并不通過K-48單一泛素鏈介導，而是由K63-、K11-、和K29-三種泛素鏈組成[38]，這種多聚泛素鏈可形成非線性的分枝狀結構。我們在國際上首次發(fā)現(xiàn)：FATS介導的p53泛素化修飾水平在DNA損傷后伴隨著p53的激活而增強，并促進p53在DNA損傷后磷酸化和乙?；揎椝降脑龈遊38]。

FATS作為p53的轉錄靶點，F(xiàn)ATS與Mdm2競爭與p53和多聚泛素化p53形成復合物，導致p53功能的穩(wěn)定和完全激活[38]。FATS還能獨立泛素化穩(wěn)定p21，在DNA損傷后嚴格控制細胞周期檢查點，進一步保證p53-p21通路抑制腫瘤發(fā)生的功能。FATS基因位于容易受到DNA損傷的基因組區(qū)域，這可能是其在腫瘤基因組中經常缺失和廣泛下調的原因。p53的充分激活可能有助于在DNA復制和DNA損傷下積極修復FATS位點的損傷，從而維持FATS基因的表達和功能[34,35,38](圖2)。

2.3 FATS基因的臨床轉化研究

臨床轉化研究顯示 FATS 基因的功能性變異rs11245007(905C>T，262D/N)其病例對照研究發(fā)現(xiàn)，CT或TT基因型對妊娠≥3胎的婦女罹患乳腺癌具有保護作用，其不受家族史的影響[39]。更重要的是，最新的 FATS 轉化醫(yī)學研究結果提供了 FATS mRNA 表達異常與乳腺癌和非小細胞肺癌發(fā)生的直接證據(jù):在23例配對乳腺癌組織和15例配對肺癌組織中，F(xiàn)ATS mRNA 在腫瘤組織中的表達水平與來自同一個體的正常組織相比(表達異常率100%)均有不同程度降低或沉默[37,40]。在對乳腺癌的臨床轉化研究中我們發(fā)現(xiàn)：FATS 高表達比 FATS 低表達患者有更好的預后(P=0.006)，通過多因素分析 FATS 高表達是接受放療乳腺癌患者的獨立預后因素(P=0.012)[37]。進一步，我們通過克隆形成實驗，發(fā)現(xiàn)高表達 FATS 可增加乳腺癌細胞的放療敏感性，敲低 FATS 導致乳腺癌細胞放療抗拒，證實 FATS 的確調控乳腺癌放療敏感性[37]。接下來應用 FATS 過表達載體 3xFlag-FATS 轉染MDA-MB-231細胞，同時用 FATS 干擾質粒 FATS-shRNA 轉染MDA-MB-231細胞作為對照，通過6Gy/f的x線照射后，運用流式細胞術觀察，結果顯示：提高 FATS 表達水平后，其對放療更加敏感，我們同時檢測了凋亡蛋白Cleaved PARP，結果顯示：FATS 高表達組Cleaved PARP 明顯升高。這些研究結果提示放療后 FATS 調控了細胞凋亡從而提高放療敏感性[37]。但是 FATS 調控細胞凋亡的分子機制仍待闡明，我們推測可能與p53蛋白的相互作用相關。在對肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)：在接受鉑類聯(lián)合化療的患者中， FATS mRNA高表達較低表達預后更好；而未接受含有鉑類化療的患者，F(xiàn)ATS mRNA表達水平則與患者預后無關，這提示FATS高表達與鉑類藥物化療敏感性相關[40]。進一步將FATS過表達質粒轉染肺癌細胞系H1299和A549，并應用順鉑對細胞進行殺傷，我們發(fā)現(xiàn)FATS過表達可以增強順鉑對肺癌細胞的殺傷能力，并增加順鉑誘導的細胞凋亡率[40]。FATS可能通過調節(jié)DNA損傷后細胞周期節(jié)點調控功能、維持基因組穩(wěn)定性、并抑制腫瘤細胞中DNA修復異常，從而增強鉑類化療藥物的抗腫瘤療效。

圖2 FATS抑癌分子機制示意圖

3 研究的意義與展望

近年來，對于脆性位點的研究越來越多，CFS位點基因具有進化上保守、與腫瘤發(fā)生發(fā)展密不可分、同時可能還參與調控DNA損傷反應信號通路，尋找確定CFS位點基因的新途徑、發(fā)掘和鑒定新的CFS基因并闡明CFS基因與癌癥發(fā)生的關系是一個頗具挑戰(zhàn)性的前沿課題，最新發(fā)現(xiàn)FATS基因極有可能是腫瘤發(fā)生早期起關鍵調控作用的候選分子標志物，并可應用于癌癥的分子診斷和風險預測，對研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要意義，可為預防和治療腫瘤提供新的策略,但是 FATS 的分子調控機制仍待進一步闡明。