劉 明，陶思行，譚九峰，陳曉亮，晉學(xué)飛，王傳芳，那萬里

(1.四平市中心人民醫(yī)院，吉林 四平136000；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院；3.榆樹市中醫(yī)院)

膀胱癌是常見的泌尿系腫瘤，在我國有較高的發(fā)病率[1]。膀胱癌的治療以手術(shù)切除為主，并輔以放療、化療，但5年生存率仍不盡如人意[2]。對膀胱癌發(fā)病機(jī)制不明確是導(dǎo)致其治療效果不佳的主要原因。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度超過200 核苷酸的不編碼蛋白質(zhì)的RNA，其可在基因組轉(zhuǎn)錄水平、基因組轉(zhuǎn)錄后水平及表觀遺傳學(xué)等層面調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而參與惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[3]。lncRNA結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物2(CCAT2)是位于人類染色體8q24的lncRNA，最早發(fā)現(xiàn)于結(jié)腸癌中，并被證實(shí)可促進(jìn)結(jié)腸癌的增殖和遷移[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CCAT2在多種惡性腫瘤中都發(fā)揮重要調(diào)控作用，如前列腺癌[5]、非小細(xì)胞肺癌[6]、胃癌[7]等。但CCAT2與膀胱癌的相關(guān)研究未見報(bào)道。本研究旨在觀察CCAT2在膀胱癌中的表達(dá)，并通過干預(yù)CCAT2表達(dá)研究其對膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響，以期為膀胱癌的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本采集選取2018年1月至2018年12月我院行手術(shù)切除的50例膀胱癌患者癌組織樣本和癌旁組織樣本(距離腫瘤組織邊緣>5 cm)，患者術(shù)前均未接受放化療治療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會審批通過，患者均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞系和主要試劑人正常膀胱上皮細(xì)胞sv-HUC-1、膀胱癌細(xì)胞株EJ、BIU87、T24、T24-ADM購于美國ATCC；DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胰蛋白酶、胎牛血清購于Hyclone公司；RT-PCR試劑、Bax單克隆抗體、Bcl-2單克隆抗購于大連Takara公司；Western blot試劑盒購于南京建成生物有限公司；LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購于Invitrogen公司；CCK8試劑盒購于碧云天試劑有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染常規(guī)復(fù)蘇細(xì)胞，用含有10%胎牛血清+1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液重懸浮細(xì)胞，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1次。收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞濃度為2×106cells/孔，采用LipofectamineTM 2000用siRNA-NC、siRNA-CCAT2對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞置于于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4 qRT-PCR檢測CCAT2表達(dá)參照Trizol試劑盒說明書提取組織/細(xì)胞中總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄總RNA至cDNA，以此cDNA為模板并根據(jù)SYBR Premix ExTaqTM說明書行qRT-PCR，用公式2-△△CT計(jì)算CCAT2的相對表達(dá)。CCAT2引物序列：上游5’-CCCTGGTCAAATTGCTTAACCT-3’，下游5’-TTATTCGTCCCTCTGTTTTATGGAT-3’；GAPDH引物序列：上游5’-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’，下游5’-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3’。

1.5 CCK-8檢測細(xì)胞增殖收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，并接種于96孔板中，細(xì)胞終濃度為2×106cells/孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，孵育10 min，用全自動酶標(biāo)儀測定波長OD450 nm處光密度值。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，將細(xì)胞置于37℃、5% CO2條件中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用凋亡試劑盒(Annexin-V/PI)進(jìn)行避光染色，1 h后上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡率=[(右上象限細(xì)胞+右下象限細(xì)胞)/總細(xì)胞數(shù)]×100%。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，將細(xì)胞置于37℃、5% CO2條件中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合率達(dá)到90%左右時(shí)，用200 μl槍頭垂直于6孔板底部做橫線劃痕，之后細(xì)胞繼續(xù)置于恒溫培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中培養(yǎng)，培養(yǎng)后24 h，于倒置光學(xué)顯微鏡下拍照(×100)觀察，利用Image J軟件測量劃痕區(qū)域?qū)挾龋⒂?jì)算細(xì)胞劃痕愈合率。

1.8 Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測樣品蛋白濃度，取200 μl樣品行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，4℃封閉4 h，后依次加入1∶2 000濃度I抗(兔抗人Bcl-2和兔抗人Bax)、1∶500濃度HRP標(biāo)記的羊抗兔II抗，按ECL試劑盒說明書行電化學(xué)發(fā)光檢測。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS20.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較用單因素方差檢驗(yàn)，兩兩間比較用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCAT2在膀胱癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)分析

CCAT2在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)(見圖1A)；與sv-HUC-1細(xì)胞比較，CCAT2在EJ、BIU87、T24、T24-ADM細(xì)胞中的表達(dá)明顯增高(P<0.05)，其中以EJ、BIU87細(xì)胞最高(見圖1B)。

2.2 轉(zhuǎn)染siRNA-CCAT2對膀胱癌細(xì)胞中CCAT2表達(dá)的影響

圖1A 膀胱癌組織及癌旁組織中CCAT2表達(dá)水平比較 圖1B 正常膀胱細(xì)胞及膀胱癌細(xì)胞中CCAT2表達(dá)水平比較

注：與癌旁組織比較，***P<0.05 注：與正常膀胱細(xì)胞比較，***P<0.05

選取CCAT2表達(dá)水平最高的兩株膀胱癌細(xì)胞EJ、BIU87為對象，并分別轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染siRNA-NC和siRNA-CCAT2，采用qRT-PCR檢測細(xì)胞中CCAT2表達(dá)。與轉(zhuǎn)染siRNA-NC相比較，轉(zhuǎn)染siRNA-CCAT2后細(xì)胞中CCAT2表達(dá)顯著降低(P<0.05)(見圖2)。

2.3 轉(zhuǎn)染siRNA-CCAT2對膀胱癌細(xì)胞增殖的影響

CCK8結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)染siRNA-NC相比較，轉(zhuǎn)染siRNA-CCAT2后EJ、BIU87細(xì)胞增殖活性均顯著降低(P<0.05)(見圖3A、3B)。

2.4 轉(zhuǎn)染siRNA-CCAT2對膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響

流式結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)染siRNA-NC相比較，轉(zhuǎn)染siRNA-CCAT2后EJ、BIU87細(xì)胞凋亡率均顯著增高(P<0.05)(見圖4)。

圖2 轉(zhuǎn)染siRNA-CCAT2對膀胱癌細(xì)胞中CCAT2表達(dá)的影響

注：與轉(zhuǎn)染siRNA-NC比較，***P<0.05

圖3A轉(zhuǎn)染siRNA-CCAT2對EJ細(xì)胞增殖的影響 圖3B 轉(zhuǎn)染siRNA-CCAT2對BIU87細(xì)胞增殖的影響

注：與轉(zhuǎn)染siRNA-NC比較，***P<0.05 注：與轉(zhuǎn)染siRNA-NC比較，***P<0.05

2.5 轉(zhuǎn)染siRNA-CCAT2對膀胱癌細(xì)胞遷移的影響

流式結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)染siRNA-NC相比較，轉(zhuǎn)染siRNA-CCAT2后EJ、BIU87細(xì)胞遷移能力均顯著減弱(P<0.05)(見圖5)。

2.6 轉(zhuǎn)染siRNA-CCAT2對膀胱癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

流式結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)染siRNA-NC相比較，轉(zhuǎn)染siRNA-CCAT2后EJ、BIU87細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)顯著減少，而Bax蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.05)(見圖6)。

圖4 轉(zhuǎn)染siRNA-CCAT2對EJ、BIU87細(xì)胞凋亡的影響

圖5 轉(zhuǎn)染siRNA-CCAT2對EJ、BIU87細(xì)胞遷移的影響

圖6A轉(zhuǎn)染siRNA-CCAT2對EJ細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 圖6B轉(zhuǎn)染siRNA-CCAT2對BIU87細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

注：與轉(zhuǎn)染siRNA-NC比較，***P<0.05 注：與轉(zhuǎn)染siRNA-NC比較，***P<0.05

3 討論

lncRNAs與癌癥密切相關(guān)。膀胱癌中存在多種lncRNAs的異常表達(dá)，如ZFAS1[8]、H19[9]、HOTAIR[10]等，對膀胱癌的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。CCAT2是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類lncRNA。Qiu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，CCAT2在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，平均上調(diào)7.5倍。Huang等[12]研究證實(shí)，CCAT2在卵巢癌組織和細(xì)胞系中均呈高表達(dá)，CCAT2高表達(dá)者其總體生存期明顯短于低表達(dá)者(P<0.05)，且CCAT2表達(dá)與FIGO分期、腫瘤分級及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。本研究中，我們通過觀察膀胱癌組織和細(xì)胞系中CCAT2表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，CCAT2在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)，且多株膀胱癌細(xì)胞中CCAT2表達(dá)均明顯高于膀胱正常上皮細(xì)胞(P<0.05)。上述結(jié)果表明，CCAT2在包括膀胱癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，其表達(dá)上調(diào)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證CCAT2在膀胱癌中的作用，我們選取了CCAT2表達(dá)量最高的兩株膀胱癌細(xì)胞EJ、BIU87為對象，觀察沉默CCAT2對細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與轉(zhuǎn)染siRNA-NC相比較，轉(zhuǎn)染siRNA-CCAT2可使得膀胱癌細(xì)胞中CCAT2表達(dá)明顯下調(diào)，同時(shí)顯著抑制細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞遷移能力(P<0.05)，表明CCAT2高表達(dá)是促使膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移的主要原因之一。類似現(xiàn)象，也已在肝癌[13]、膠質(zhì)瘤[14]中得到證實(shí)。流式結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA-CCAT2后膀胱癌細(xì)胞凋亡率明顯提高，與轉(zhuǎn)染siRNA-NC相比差異顯著(P<0.05)，表明CCAT2是一種膀胱癌細(xì)胞生長正調(diào)控因子，扮演著“促癌基因”作用，這與CCAT2在其他腫瘤中的作用相一致[15，16]。因此，深入研究CCAT2促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞生長機(jī)制對于膀胱癌的防治具有重要意義。

凋亡過程的啟動與細(xì)胞的“命運(yùn)”息息相關(guān)，而Bcl-2/Bax比值是啟動細(xì)胞凋亡的“分子開關(guān)”。Bcl-2、Bax是凋亡網(wǎng)絡(luò)中的核心蛋白，其中Bcl-2具有抑制細(xì)胞凋亡作用，而Bax則可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2/Bax比值決定了異二聚體(Bcl-2/Bax)與同二聚體(Bax/Bax)的比值，是反映細(xì)胞凋亡水平的重要指標(biāo)[17]。當(dāng)Bcl-2過度表達(dá)或Bax表達(dá)降低，則易形成Bcl-2/Bax異二聚體，從而抑制細(xì)胞凋亡；反之，當(dāng)Bcl-2表達(dá)下調(diào)或Bax表達(dá)增高，則可形成Bax/Bax同二聚體，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[18]。本研究結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染siRNA-NC相比較，轉(zhuǎn)染siRNA-CCAT2后膀胱癌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)顯著減少，而Bax蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.05)。上述結(jié)果提示，沉默CCAT2可下調(diào)Bcl-2表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Bax表達(dá)，使得Bcl-2/Bax比值降低，而這也是其促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制之一。

綜上所述，CCAT2在膀胱癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，沉默CCAT2可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移，并促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控Bcl/Bax比率有關(guān)。