高棟梁，高東東，池 凱，楊喜明

(1.延安大學附屬醫(yī)院 燒傷整形手外科，陜西 延安716000；2.鄭州鄭東諾亞一家醫(yī)療美容門診部 整形外科，河南 鄭州450000)

瘢痕疙瘩是一種良性的真皮纖維增生性腫瘤，是皮膚科和外科手術中最常見、最棘手的問題之一。瘢痕疙瘩在正常的皮膚上擴張超過原始傷口的邊緣，常伴有疼痛、瘙癢、畸形甚至嚴重的功能損害，嚴重影響患者的生活質量[1]。由于對瘢痕疙瘩的發(fā)病機制認識不足，瘢痕疙瘩的治療仍有許多問題需要解決，并且瘢痕疙瘩的復發(fā)率高，術后畸形多，單純手術切除難以治愈[2,3]，因此需要開發(fā)新的治療策略。微小RNA(microRNA，miRNA/miR)是一種短鏈的非編碼RNA，大約包含22個核苷酸，能夠通過與靶mRNA的互補作用在轉錄后調節(jié)基因表達[4]。miRNA被認為在許多皮膚疾病中失調，包括瘢痕疙瘩[5]。研究表明，miR-497-5p在胃癌組織中下調表達，抑制其表達促進胃癌細胞的增殖和生長，過表達miR-497-5p抑制胃癌細胞的增殖和生長[6]。miR-497-5p在結直腸癌組織和細胞中低表達，上調其表達抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲[7]。與正常皮膚相比，瘢痕疙瘩組織中含有WW結構域的E3泛素蛋白連接酶1(WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 1，WWP1) mRNA水平顯著升高，可能參與成纖維細胞過度增生及細胞外基質沉積而導致瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展[8]。但miR-497-5p在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達及其對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和凋亡的影響，且miR-497-5p對WWP1是否存在靶向調控關系目前還尚未可知。因此，本研究以人瘢痕疙瘩成纖維細胞(Keloid Fibroblast，KFB)為對象，考察miR-497-5p的表達，并評價miR-497-5p是否通過靶向調控WWP1影響KFB的細胞增殖和凋亡，旨在揭示其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco，s Modified Eagle Medium)購自購自Gibco公司，胎牛血清、TRIzol、Lipofectamine 2000、實時熒光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)檢測試劑盒購自Invitrogen公司，WWP1、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)蛋白抗體購自美國Cellular Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶標記二抗購自北京中杉金橋生物公司，miR-497-5p、anti-miR-497-5p、si-WWP1、pcDNA-WWP1、熒光素酶報告載體購自上海GenePhama公司，噻唑藍(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)購自美國Sigma公司，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司。

1.2 細胞分離培養(yǎng)

收集延安大學附屬醫(yī)院患者術后瘢痕疙瘩和正常皮膚標本，參照楊力等[9]的方法，進行KFB和正常皮膚成纖維細胞(Normal Skin Fibroblast，NFB)的分離培養(yǎng)，即新鮮標本經0.5%洗必泰浸泡、生理鹽水洗滌后剪碎成0.5-1 mm3大小的樣本，在含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細胞生長至70%匯合時進行傳代。

1.3 qPCR檢測miR-497-5p、WWP1 mRNA表達

使用TRIzol試劑提取KFB和NFB總RNA，逆轉錄后，以制成的cDNA為模板，依據qPCR試劑盒說明書的指示，以2-ΔΔCt法測定miR-497-5p、WWP1 mRNA表達。引物序列：miR-497-5p正向5’-CCTTCAGCAGCACACTGTGG-3’，反向5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3’；內參U6正向5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；WWP1正向5’-GTATGGATCCTGTACGGCAGCA-3’，反向5’-GTTGTGGTCTCTCCCATGTGGT-3’；內參GAPDH正向5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGGA- 3’，反向5’-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT- 3’。

1.4 Western blot檢測WWP1蛋白表達

RIPA裂解液提取KFB和NFB總蛋白，將20 μg蛋白樣品進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)以分離蛋白，轉至聚偏氟乙烯膜，經5%脫脂奶粉封閉，將膜與1:1000稀釋的WWP1蛋白一抗4℃共同孵育過夜，Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液(Tris buffered saline with Tween,TBST)充分洗滌，之后加入1∶5000稀釋的二抗，室溫孵育1 h，TBST充分洗滌后進行曝光顯影，GAPDH作為內參，分析WWP1蛋白表達。

1.5 雙熒光素酶報告實驗

利用TargetScan(http://www.targetscan.org/)預測工具發(fā)現miR-497-5p與WWP1的3’非編碼區(qū)(3’untranslated region，3’UTR)中存在部分互補配對的堿基，猜想WWP1可能是miR-497-5p的靶基因。分別構建包含miR-497-5p結合位點的WWP1野生型(WT)和突變型(MUT)3’UTR熒光素酶載體，分別記為WT-WWP1和MUT-WWP1，將其與miR-497-5p共轉染入KFB內，48h進行雙熒光素酶活性檢測。

1.6 細胞轉染

將KFB接種于6孔板，密度為1×105個/mL細胞。miR-497-5p過表達及其陰性對照miR-NC使用miR-497-5p模擬物、miR-NC轉染細胞，抑制WWP1表達與其陰性對照用si-WWP1、si-NC轉染細胞，WWP1過表達和其陰性對照用pcDNA-WWP1、pcDNA進行轉染。所有轉染均按照制造商的說明，使用Lipofectamine 2000 進行操作。轉染48 h后，根據1.3或1.4所述方法檢測miR-497-5p或WWP1、CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax蛋白表達，并測定細胞增殖、凋亡。

1.7 MTT法檢測細胞增殖

在96孔板中接種KFB，密度為5×104個/mL，連續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，加入MTT溶液20 μl，孵育4 h，加入二甲基亞砜150 μl，搖床震蕩反應10 min，通過酶標儀獲得波長490 nm處的KFB吸光值(OD490 nm)。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡

Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒用于細胞凋亡測定。收集1×105個KFB，加入緩沖液500 μl制成細胞懸液，加入Annexin V-FITC 5 μl充分混合，加入PI 5 μl充分混合，遮光孵育15 min，通過流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 miR-497-5p和WWP1在瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞中的表達

qPCR檢測數據顯示(表1)，KFB中miR-497-5p表達量明顯低于NFB組，WWP1 mRNA表達量顯著高于NFB組(P<0.05)。Western blot檢測結果表明(表1、圖1)，KFB中WWP1蛋白表達量明顯高于NFB組(P<0.05)。

2.2 miR-497-5p靶向調控WWP1的表達

TargetScan(http://www.targetscan.org/)工具預測發(fā)現(圖2A)，WWP1的3’UTR中含有與miR-497-5p互補的核苷酸序列。雙熒光素酶報告實驗數據表明(表2)，miR-497-5p明顯抑制WT-WWP1熒光素酶活性(P<0.05)，對MUT-WWP1熒光素酶活性無顯著影響。Western blot檢測結果顯示(表3、圖2B)，miR-497-5p較miR-NC組顯著抑制WWP1蛋白表達量，anti-miR-497-5p較anti-miR-NC明顯提高WWP1蛋白表達量(P<0.05)。

圖1 WWP1蛋白表達

表1 miR-497-5p和WWP1在瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞中的表達

注：與NFB組比較，*P<0.05

表2 雙熒光素酶報告實驗

注：與miR-NC組比較，*P<0.05

表3 miR-497-5p調控WWP1蛋白的表達

注：與miR-NC組比較，*P<0.05；與anti-miR-NC組比較，#P<0.05

2.3 miR-497-5p過表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和凋亡的影響

在KFB中轉染miR-497-5p，發(fā)現與miR-NC組比較，miR-497-5p表達量大幅增加(P<0.05，表4)。與miR-NC組比較，miR-497-5p過表達明顯降低KFB 48 h、72 h的細胞活性(表4)，提高細胞凋亡率(表4、圖3B)，減少CyclinD1、Bcl-2蛋白表達量，提高p21、Bax蛋白水平(表4、圖3A)，均具有顯著差異(P<0.05)。

2.4 抑制WWP1表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和凋亡的影響

在KFB中轉染si-WWP1，發(fā)現WWP1蛋白表達量顯著低于si-NC組(P<0.05，表5、圖4)。同si-NC組相比，抑制WWP1表達明顯降低KFB 48 h、72 h的細胞活性，提高細胞凋亡率(表5)，降低CyclinD1、Bcl-2蛋白水平，增加p21、Bax蛋白表達量(表5、圖4)，差異均具有顯著性(P<0.05)。

圖2 miR-497-5p靶向調控WWP1的表達

圖3 miR-497-5p過表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和凋亡的影響

表4 miR-497-5p過表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和凋亡的影響

注：與miR-NC組比較，*P<0.05

2.5 WWP1過表達逆轉了miR-497-5p過表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和凋亡的作用

相較于miR-NC組，miR-497-5p過表達明顯減少KFB中WWP1、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達量，提高p21、Bax蛋白水平(表6、圖5)，降低48 h、72 h的細胞活性，并增加細胞凋亡率(表6)，均具有顯著差異(P<0.05)。與miR-497-5p+pcDNA組比較，共轉染miR-497-5p和pcDNA-WWP1明顯提高KFB中WWP1、CyclinD1、Bcl-2蛋白水平，降低p21、Bax蛋白表達量(表6、圖5)，提高48 h、72 h的細胞活性，及減少細胞凋亡率(表6)，差異均具有顯著性(P<0.05)。

表5 抑制WWP1表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和凋亡的影響

注：與si-NC組比較，*P<0.05

圖4 WWP1和增殖、凋亡相關蛋白表達

3 討論

瘢痕疙瘩是一種良性，局部侵襲性和復發(fā)性皮膚纖維增生性疾病，它是人類獨有的，代表了一系列異常傷口愈合的終點，具有美學上的毀容性，并可導致重大功能損害[10]。瘢痕疙瘩是由于皮膚損傷后創(chuàng)面愈合反應異常引起的，其特征是成纖維細胞增殖增加，過度合成和沉積細胞外基質，尤其是膠原蛋白，長期持續(xù)纖維化和炎癥[11]，在真皮中呈舌狀前進邊緣，類似于浸潤性腫瘤生長[10]。現階段，瘢痕疙瘩對所有臨床治療都有抵抗作用，術后復發(fā)率高，危及許多患者的生活質量。然而瘢痕疙瘩形成的關鍵機制尚不清楚。因此，進一步研究瘢痕疙瘩的細胞和分子機制可能是改善瘢痕疙瘩臨床管理策略的關鍵。

圖5 WWP1和增殖、凋亡相關蛋白表達

表6 WWP1過表達逆轉了miR-497-5p過表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和凋亡的作用

注：與miR-NC組比較，*P<0.05；與miR-497-5p+pcDNA組比較，#P<0.05

miRNA是一類高度保守的內源性非編碼RNA，它們通過與靶mRNA 3’UTR結合，負調控mRNA的表達，導致降解或翻譯抑制，影響細胞增殖、分化、發(fā)育、代謝和凋亡等許多生物學過程中[12]。作為許多疾病過程中必不可少的表觀遺傳調控因子，miRNA在瘢痕疙瘩中表達異常，參與瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展，可以作為瘢痕疙瘩有希望的新型預防和治療靶標[13,14]。例如，瘢痕疙瘩組織和瘢痕疙瘩成纖維細胞中miR-141-3p的水平顯著低于正常組織和正常皮膚成纖維細胞，miR-141-3p過表達可顯著降低瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖、遷移和促進細胞凋亡，而miR-141-3p敲低時，對瘢痕疙瘩成纖維細胞作用相反[15]。miR-205-5p在瘢痕組織標本和細胞中均有明顯的低表達，miR-205-5p過表達顯著損害細胞活力，誘導細胞凋亡，抑制細胞的侵襲和遷移能力，可以拮抗瘢痕疙瘩[16]。miR-497-5p已被提出作為人類癌癥的抑癌miRNA，資料顯示，miR-497-5p在非小細胞肺癌中表達下調，過表達miR-497-5p抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和侵襲[17]。miR-497-5p在骨肉瘤組織和細胞中表達水平降低，上調其表達抑制骨肉瘤細胞的增殖，并誘導細胞凋亡[18]。但是miR-497-5p在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的作用鮮見報道。本研究中，與正常皮膚成纖維細胞相比，miR-497-5p在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達明顯下調(P<0.05)。miR-497-5p過表達明顯降低瘢痕疙瘩成纖維細胞48 h、72 h的細胞活性、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達，以及提高細胞凋亡率、p21、Bax蛋白水平(P<0.05)，顯示出一定的抑制瘢痕疙瘩的活性。

WWP1在多種人類惡性腫瘤中表達上調，是一種潛在的致癌基因，在細胞增殖、凋亡和侵襲中發(fā)揮重要作用[19-21]。研究發(fā)現，與正常對照組相比，結直腸癌組織中WWP1 mRNA和蛋白普遍上調，WWP1表達高的結直腸癌患者總體生存期較低(P<0.001)，無病生存期較低(P=0.001)，是影響結直腸癌患者總體生存率的獨立預后因素。另外，WWP1的缺失顯著抑制結直腸癌細胞的腫瘤增殖和侵襲性，且過表達WWP1的細胞明顯具有更高的增殖和侵襲能力[22]。WWP1在骨肉瘤和胃癌組織中高表達，敲低其表達抑制骨肉瘤和胃癌細胞的增殖，促進細胞凋亡[23,24]。本實驗中，瘢痕疙瘩成纖維細胞中WWP1 mRNA和蛋白表達明顯上調，抑制WWP1表達明顯降低瘢痕疙瘩成纖維細胞48 h、72 h的細胞活性、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達，提高細胞凋亡率、p21、Bax蛋白表達(P<0.05)，提示抑制WWP1表達可能有助于抑制瘢痕疙瘩生長。另外，生物信息學預測結合雙熒光素報告實驗證實miR-497-5p靶向調控WWP1表達。WWP1過表達逆轉了miR-497-5p過表達抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、WWP1、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達的作用，和促進細胞凋亡、p21、Bax蛋白表達的作用。這些結果說明，靶向調控WWP1表達可能是miR-497-5p抑制瘢痕疙瘩的重要途徑之一。

綜上所述，miR-497-5p在瘢痕疙瘩成纖維細胞中表達下調，過表達miR-497-5p可以明顯抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖，并促進細胞凋亡。另外，WWP1在瘢痕疙瘩成纖維細胞中表達上調，miR-497-5p對瘢痕疙瘩成纖維細胞的抑制作用可能是通過直接靶向調控WWP1表達來實現的，為瘢痕疙瘩的管理提供了新的線索。