姜 瀟,孫 梅

(大連市中心醫(yī)院 消化內(nèi)二科,遼寧 大連116033)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是西方國(guó)家最常見的慢性肝臟疾病，在我國(guó)的發(fā)病率也逐年遞增。目前其發(fā)病機(jī)制尚不十分明確[1]。目前，肝活檢仍然是唯一區(qū)分單純脂肪變性與NASH、明確肝功能損傷及纖維化程度的方法，但由于其有創(chuàng)性、價(jià)格昂貴及潛在的并發(fā)癥，臨床應(yīng)用受限[2]。因此，迫切需要開發(fā)可對(duì)NAFLD進(jìn)行肝損傷程度的評(píng)估、明確NASH及顯著纖維化的非侵入性生物標(biāo)志物。

Ⅰ型纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)是一種豐富的脂肪組織非特異性脂肪細(xì)胞因子，為絲氨酸蛋白酶抑制劑，在廣泛的生理和病理過程，包括纖溶，凝血，炎癥和傷口愈合中起關(guān)鍵作用[3]。近年來(lái)，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)NAFLD患者外周血PAI-1水平較正常對(duì)照增高，來(lái)自動(dòng)物研究的證據(jù)表明PAI-1在NAFLD發(fā)病中的潛在作用，減少PAI-1的產(chǎn)生可顯著逆轉(zhuǎn)肝脂肪變性和肝臟脂質(zhì)積累[4]。因此，我們推測(cè)PAI-1外周血水平是否與NAFLD發(fā)生相關(guān)，且可否作為NAFLD可能的生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

根據(jù)“非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018 更新版)”，納入大連市中心醫(yī)院2019年7月至2019年12月，臨床診斷為NAFLD患者38例為實(shí)驗(yàn)組,而無(wú)其他肝病(病毒性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、硬化性膽管炎、自身免疫性肝炎、血色素沉著癥、威爾遜病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏癥，或藥物性肝病)，并排除所有降脂、降糖、降壓藥物治療的患者，同時(shí)選取性別和年齡匹配的正常對(duì)照者50例作為對(duì)照組。

1.2 ELISA法測(cè)定血漿中PAI-1水平

研究中使用的88份血樣均被收集到含EDTA的試管中，在3 000×g離心15 min分離血細(xì)胞。將血漿收集到另一個(gè)試管中，并在-80℃下保存，直到實(shí)驗(yàn)使用。

檢測(cè)了血漿中的PAI-1表達(dá)水平。商業(yè)ELISA試劑盒(Lifespan Biosciences Inc.,Seattle,W A,USA)用于檢測(cè)血漿中PAI-1濃度(目錄號(hào)LS-F12251)。所有步驟均按照制造商的說明進(jìn)行：(1)標(biāo)準(zhǔn)，將空白和實(shí)驗(yàn)樣品(用樣品稀釋液預(yù)處理)加入96孔微孔板中，用靶向特異性捕獲抗體(抗PAI-1)預(yù)涂并在37℃下孵育1 h。(2)吸取各孔液體后，在微孔板中加入生物素結(jié)合檢測(cè)二級(jí)抗體在37℃下孵育1 h。(3)再次抽吸液體，并用洗滌緩沖液清洗每口井3次。然后，將每口井中的液體取出，用沖洗緩沖液沖洗3次后，在37℃下將每口井注入HRP共軛物30 min。(4)同樣，在至少?zèng)_洗5次后，在37℃下與四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物孵育10-20 min。(5)最后，用50 μl的停止溶液終止顯色反應(yīng)，在450 nm波長(zhǎng)下用微板閱讀器立即測(cè)定各孔的光密度值。用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每孔PAI-1濃度(ng/mL)。

1.3 血漿膽汁酸測(cè)定

采集被觀察對(duì)象晨間空腹靜脈血3 ml，分離血漿，在3 000×g離心15 min分離血細(xì)胞并收集上層血漿。應(yīng)用循環(huán)酶法測(cè)定血漿膽汁酸濃度(μmol/L)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS軟件(SPSS Inc.,SPSS Standard version 18.0,Chicago,IL,USA)和GraphPad Prism軟件(GraphPad Software Inc.,GraphPad Prism version 5.01,La Jolla,CA,USA)進(jìn)行?；贙olmogorov-Smirnov檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Studentt檢驗(yàn)對(duì)連續(xù)變量進(jìn)行分析，采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)對(duì)分類變量進(jìn)行分析，P值小于0.05代表具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用單變量logistic回歸模型評(píng)估各變量與NAFLD的關(guān)系。

每位受試者均獲得書面知情同意。研究方案符合1975年赫爾辛基宣言的道德準(zhǔn)則，并通過了大連市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

2 結(jié)果

2.1 基線特征及血漿PAI-1表達(dá)分析

本研究共納入NAFLD患者38例(21名男性和17名女性)和對(duì)照組50例(30名男性和20名女性)的基線特征如表1所示。NAFLD患者與正常對(duì)照組相比，NAFLD組BMIs、收縮壓和PAI-1水平較高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，而年齡、膽汁酸及性別，兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.5)。

2.2 NAFLD相關(guān)因素的單因素和多因素分析

采用單因素logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)許多因素與NAFLD的存在有關(guān)。然而，根據(jù)多元logistic回歸分析，結(jié)果表明PAI-1與NAFLD的存在獨(dú)立相關(guān)，OR 值為1.190，p值小于0.001。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)BMI與NAFLD發(fā)生獨(dú)立相關(guān)，P值小于0.001。以上結(jié)果見表2。

表1 NAFLD患者與健康對(duì)照組基線特征及血漿PAI-1表達(dá)

表2 NAFLD發(fā)病相關(guān)因素的單因素和多因素分析

3 討論

NAFLD是世界上成人和兒童最常見的慢性肝病，范圍從單純性脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎、纖維化和肝硬化[5]。NAFLD與代謝綜合征的特征密切相關(guān)，尤其是肥胖、胰島素抵抗和血脂異常，以及心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加。

導(dǎo)致肝臟脂肪變性的確切代謝途徑仍不清楚，NAFLD和心血管疾病之間的聯(lián)系尚不十分清楚。在提出的機(jī)制中，纖溶系統(tǒng)與NAFLD、胰島素抵抗和動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)聯(lián)[6]。文獻(xiàn)報(bào)道，PAI-1濃度升高導(dǎo)致血管系統(tǒng)血栓清除障礙并可能影響動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展[7]。同時(shí)PAI-1是由肝細(xì)胞和脂肪細(xì)胞共同產(chǎn)生的纖溶途徑中的一種急性期蛋白，在肥胖、血脂異常和胰島素抵抗中呈升高趨勢(shì)。

最新的動(dòng)物模型研究提示PAI-1和NAFLD的發(fā)病與肝臟脂質(zhì)輸出的抑制有關(guān)[8]。然而，其他研究表明，PAI-1升高與肝臟脂肪變性之間的聯(lián)系可能是由肥胖和胰島素抵抗介導(dǎo)的[9]。PAI-1在NAFLD發(fā)展中的作用仍需進(jìn)一步研究，其亦可能成為NAFLD潛在的治療靶點(diǎn)。

綜上所述，PAI-1與NAFLD獨(dú)立相關(guān)。PAI-1可能成為NAFLD診斷的重要生物標(biāo)志物，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。