余啟馨，葉建紅，林 旋，王家樂，何東盈，勞美鈴

(1.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州510405；2.佛山市中醫(yī)院 內(nèi)分泌科，廣東 佛山528000)

目前非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的發(fā)病機制仍未完全明確，胰島素抵抗是NAFLD發(fā)病的重要環(huán)節(jié)之一。而炎癥因子又與胰島素抵抗關(guān)系密切，近年來研究顯示，炎癥因子如超敏-C反應蛋白(hs-CRP)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等可以通過影響信號傳導通路引起胰島素抵抗[1]，可能是胰島素抵抗的主要分子機制。本研究采用評估胰島素抵抗的金標準—高胰島素正常血糖鉗夾實驗，定量檢測葡萄糖代謝率(M)，精確評估胰島素抵抗程度，探討NAFLD患者胰島素抵抗與血清炎癥因子hs-CRP、IL-6、TNF-α水平變化的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

所有研究對象均來自佛山市中醫(yī)院內(nèi)分泌科，根據(jù)2018年中華醫(yī)學會肝臟病學分會脂肪肝和酒精性肝病學分會提出的NAFLD診斷標準[2]篩選NAFLD患者30例，其中男18例，女12例，年齡32-60歲。排除已明確診斷為糖尿病、合并嚴重肝、腎功能損害、心腦血管病、甲狀腺疾病等患者。另選擇同期年齡、性別相匹配的健康體檢者30例為對照組，男19例，女11例，經(jīng)檢測血糖、血脂、肝功能、血壓均正常。

1.2 方法

1.2.1生化指標與血清炎癥指標測定 采用酶化學發(fā)光法測定胰島素， C 肽及皮質(zhì)醇；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測 hs-CRP，IL-6，TNF-α，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.2高胰島素-正常血糖鉗夾試驗 所有受試者均進行高胰島素-正常血糖鉗夾試驗，具體操作方法參考賈偉平[3]的報道以及我們改進的方法[4]。 操作方法：試驗前一晚8點后禁食，試驗當天上午8點排空小便后平靜臥床。分別于兩側(cè)上肢建立靜脈通道，一側(cè)上肢置于溫度為45±3℃的恒溫套中以獲得動脈化的靜脈血樣，輸注生理鹽水以維持取血，另一側(cè)用于輸注20%葡萄糖液和胰島素溶液。在鉗夾試驗開始10 min內(nèi)輸注負荷量胰島素溶液(Novolin R，40 U/mL，丹麥Novo公司)，使血漿胰島素水平迅速升高，隨后140 min內(nèi)以40 mU·m-2·min-1速率持續(xù)輸注，在此期間，每5 min測定1次動脈化的靜脈血葡萄糖。鉗夾期間每10 min取血測定胰島素，每30 min取血標本測 C肽和皮質(zhì)醇。計算鉗夾過程中120-150 min(穩(wěn)態(tài)期)的M，作為評價IR程度的指標。所有血樣均離心分離血清，-20℃保存待測胰島素，C肽及皮質(zhì)醇。實驗結(jié)束后留取小便測定尿糖濃度。

1.2.3統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計分析在SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包上完成，采用兩獨立獨立樣本t檢驗、秩和檢驗，相關(guān)分析采用Pearson法。顯著性水準為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 NAFLD組與對照組基線資料、生化指標與炎癥指標比較

見表1。兩組在性別、年齡等方面無顯著差異(P>0.05)，資料具有可比性；兩組在TC、LDL-C等方面無顯著性差異(P>0.05)，NAFLD組的WC，BMI，2hPG，F(xiàn)INS，TG，ALT、AST等均顯著高于對照組(P<0.01)，HDL-C顯著低于對照組(P<0.01)； NAFLD 組hs-CRP、IL-6 和 TNF-α 水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表1 對照組與NAFLD組臨床資料、生化指標IL-6、hs-CRP、TNF-α比較

注：△P>0.05 vs對照組，*P<0.01 vs對照組，IL-6、hs-CRP、TNF-α用中位數(shù)(上-下1/4)表示。

2.2 高胰島素-正常血糖鉗夾技術(shù)的建立與評估

2.2.1鉗夾過程中血糖、血清胰島素水平 基礎(chǔ)狀態(tài)對照組和NAFLD組血糖水平分別為(5.07±0.60) mmol/L和(5.58±0.63) mmol/L，在鉗夾試驗開始30 min后直至試驗結(jié)束，血糖穩(wěn)定在目標值5.0 mmol/L，血糖變異度<5%?；A(chǔ)狀態(tài)對照組和NAFLD組胰島素水平分別為(9.03±3.30) mIU/L和(12.96±5.06)mIU/L，正常血糖鉗夾開始后，血清胰島素水平迅速升高，在10 min達到高峰，對照組和NAFLD組分別為(97.28±8.61) mIU/L和(125.51±11.78) mIU/L，隨后維持在一個高水平直至鉗夾結(jié)束，對照組和NAFLD組分別為(66.75±5.67) mIU/L和(73.64±6.59) mIU/L。

2.2.2鉗夾過程中內(nèi)源性胰島素分泌與皮質(zhì)醇變化 如表2所示，基礎(chǔ)狀態(tài)對照組和NAFLD組C肽水平分別為(415.35±189.66) pmol/L和(601.54±201.23) pmol/L，與基礎(chǔ)狀態(tài)相比，兩組C肽水平在整個鉗夾過程各個時點中均呈下降趨勢?；A(chǔ)狀態(tài)對照組和NAFLD組皮質(zhì)醇水平分別為(211.84±121.37)nmol/L 和(224.74±105.38)nmol/L ，與基礎(chǔ)狀態(tài)相比較，兩組皮質(zhì)醇水平在整個鉗夾過程各個時點中均無異常升高。

2.2.3高胰島素正常鉗夾實驗中葡萄糖代謝 葡萄糖輸注率在鉗夾試驗的前60 min內(nèi)上升較快，NAFLD組的葡萄糖輸注率在60 min時為(3.48±0.29) mg·kg-1·min-1，對照組為(6.75±0.43)mg·kg-1·min-1，此后兩組趨于緩慢上升，在120 min時達到穩(wěn)態(tài)。穩(wěn)態(tài)時(120-150 min)對照組和NAFLD組的M分別為(8.65±1.63 )mg·kg-1·min-1和(4.72±1.37)mg·kg-1·min-1，NAFLD組的M顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.3 M值與各指標的相關(guān)分析

在NAFLD組，與M相關(guān)的臨床指標有WC、BMI、TG、HDL-C、FINS，r值分別為-0.483、-0.449、-0.565、0.433、-0.578，P分別為0.005、0.012、0.001、0.015、0.001，IL-6、hs-CRP及TNF-α均與M呈負相關(guān)(r=-0.563、-0.580、-0.598，P=0.001、0.001 、0.001)，見表3。

表2 鉗夾試驗中對照組與NAFLD組C肽與皮質(zhì)醇變化

表3 NAFLD組M值與各指標的相關(guān)分析

3 討論

NAFLD的發(fā)病機制尚未全明了，也缺乏特異的針對性治療藥物。已有相關(guān)細胞實驗，動物實驗以及臨床研究等表明，胰島素抵抗可能是NAFLD的重要發(fā)病機制之一[5，6]。然而在既往的研究中，評估胰島素胰島素抵抗的方法大多采用HOMA-IR，這一方法雖簡單易行，而最大局限是干擾因素太多，也不能精確、定量評估胰島素抵抗程度。為此，我們采用評估胰島素抵抗的“金標準”—高胰島素正常血糖鉗夾技術(shù)，檢測NAFLD患者的M，評估其胰島素抵抗程度。本研究結(jié)果顯示，NAFLD患者的M顯著低于正常人群，表明其有明顯的胰島素抵抗。同時，本研究中也發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者具有明顯的超重，高血脂，糖耐量異常等臨床特征，提示NAFLD與代謝綜合征(MS)具有密切的聯(lián)系，其胰島素抵抗的發(fā)生可能是諸多代謝紊亂共同導致的結(jié)果，也提示我們在NAFLD的防治中更應注重整體的綜合治療。

近年來，炎癥機制與胰島素抵抗的關(guān)系已成為當今研究的熱點。研究表明，2型糖尿病及肥胖狀態(tài)下白色脂肪組織中積聚的巨噬細胞和前脂肪細胞可分泌大量炎癥因子，各種炎癥因子主要通過 IKK/NF-κB通路導致胰島素抵抗。在既往的研究發(fā)現(xiàn)，MS人群的M明顯降低，血漿炎癥抑制白介素10明顯降低[7]，炎癥因子白介素18明顯升高，提示MS人群的胰島素抵抗與炎癥變化有關(guān)。此外，我們進行了MS人群M與血清脂肪因子關(guān)系進行研究，結(jié)果表明[8]， MS人群的葡萄糖代謝率明顯降低，血清脂聯(lián)素明顯降低，瘦素與抵抗素水平明顯升高，其胰島素抵抗與血清脂聯(lián)素降低，瘦素與抵抗素升高有關(guān)。為了進一步探討與MS關(guān)系密切的NAFLD患者的胰島素抵抗與炎癥因子的關(guān)系，本研究檢測了評估慢性炎癥狀態(tài)的代表性指標TNF-α，IL-6與hs-CRP水平。結(jié)果顯示，NAFLD 患者血清的TNF-α，IL-6與hs-CRP水平均顯著升高，提示本組NAFLD患者體內(nèi)存在明顯的慢性炎癥狀態(tài)。

CRP主要在肝臟合成，為維持其作為急性期反應物的作用，肝臟中CRP的產(chǎn)生在很大程度上受促炎細胞因子IL-6和白細胞介素1β(IL-1β)的影響， IL-6似乎在調(diào)節(jié)CRP表達中起著更重要的作用，TNF-α可通過刺激IL-6的表達從而增強肝臟CRP的合成，反過來CRP也可以刺激單核細胞釋放IL-6，IL-1和TNF-α，發(fā)揮致炎作用。Lee[9]等研究證實，健康人hs-CRP水平的升高可增加NAFLD的危險性，升高的hs-CRP水平與肝臟的脂肪含量正相關(guān)。Yeniova等[10]的研究證實，hs-CRP與肥胖的NAFLD患者脂肪組織和肝臟的脂肪變性密切相關(guān)，并可作為預測NAFLD肝脂肪變性的指標。

目前研究顯示IL-6 可導致肝細胞胰島素抵抗[11]， IL-6是否可導致脂肪細胞和骨骼肌細胞胰島素抵抗?尚存在爭議。多數(shù)學者認為IL-6 在脂肪細胞和骨骼肌細胞通過SOCS-3 導致胰島素抵抗。Klover等[12]發(fā)現(xiàn)持續(xù) 5 天輸注hIL-6 并沒有改變小鼠骨骼肌胰島素敏感性。

TNF-α主要由活化的單核巨噬細胞分泌，研究發(fā)現(xiàn)肥胖的嚙齒類動物脂肪組織中TNF-α過度表達，TNF-α水平升高與脂肪組織，肝臟與骨骼肌等的胰島素抵抗均有密切關(guān)系[13]。很早以前就有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α至少是鼠類胰島素敏感性的重要調(diào)節(jié)因子。TNF-α在體外可引起胰島素受體底物-1(IRS-1)的絲氨酸磷酸化，而絲氨酸磷酸化的IRS-1會抑制胰島素受體激酶活性及下游包括磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)在內(nèi)的信號通路的激活。

有動物的體內(nèi)和體外實驗研究證實，TNF-α，IL-6與hs-CRP水平升高與NF-κB，MAPK及AMPK等信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān)[14]。而NF-κB，MAPK及AMPK均與胰島素抵抗發(fā)生有著密切關(guān)系，這提示炎癥因子TNF-α，IL-6與hs-CRP可能通過NF-κB，MAPK及AMPK通路導致NAFLD胰島素抵抗。而臨床NAFLD患者的胰島素抵抗是否與炎癥因子有關(guān)呢？本研究相關(guān)分析結(jié)果證實，本組NAFLD患者的葡萄糖代謝率均與TNF-α，IL-6及hs-CRP水平呈負相關(guān)關(guān)系，提示NAFLD患者的胰島素抵抗與TNF-α，IL-6及hs-CRP水平升高有關(guān)。而具體機制是否涉及NF-κB，MAPK及AMPK通路，有待進一步研究證實。