隋小芳，華玥祺，鄒玉敏，苑露丹，費(fèi)秀斌，劉春輝，黃佳濱，姜秀政，王鳳玲*

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 健康管理體檢中心，黑龍江 佳木斯154002；2.佳木斯大學(xué)研究生部；3.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 消毒供應(yīng)科；4.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 老年病科)

原發(fā)性高血壓(Essential hypertension,EH)和高尿酸血癥(Hypemricemia,HUA)在全世界范圍內(nèi)都是較為常見的慢性疾病，這兩種疾病在我國的患病率呈逐年增加趨勢[1,2]。目前對于亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因多態(tài)性與疾病的相關(guān)性研究多為單種疾病的研究，而EH合并HUA共病的研究較為缺乏。本研究對MTHFR基因多態(tài)性與EH合并HUA共病之間的相關(guān)性進(jìn)行了研究，為該基因在EH合并HUA共病診斷和治療的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本項(xiàng)研究收集2017年6月至2018年7月間，在佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診及體檢中心體檢的人群為研究對象，共納入符合入組標(biāo)準(zhǔn)的受試者共392例，其中EH組109人，HUA組86人，EH合并HUA組95人，健康對照組102人。各組入組人群均為符合相關(guān)指南診斷標(biāo)準(zhǔn)的成年人，并簽署了知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：痛風(fēng)患者、肝腎功能不全者、近期服用過氫氯噻嗪等可影響血尿酸藥物者、甲亢或甲減患者、孕婦及哺乳期婦女。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

基因組DNA提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)、限制性內(nèi)切酶MIuI(北京擎科生物有限公司)、HRM Light Scanner TMHR-I 96儀和LC-greenPLUS飽和熒光染料(美國Idaho公司)、PCR儀C-1000(美國Bio-Rad公司)。

1.3 樣本資料采集和DNA制備

記錄受試者的性別、年齡、標(biāo)準(zhǔn)化測量的血壓、生化指標(biāo)(尿酸、血漿同型半胱氨酸、空腹血糖等)等資料。此外，在獲得受試者的允許后使用標(biāo)準(zhǔn)EDTA抗凝管收集5 ml靜脈血，儲存于-20℃冰箱。待所有血樣集齊后統(tǒng)一提取DNA，使用Nanodrop ND-1000分光光度計(jì)進(jìn)行濃度和純度的測定，最后將樣本DNA的濃度用ddH2O標(biāo)化至90-120 ng/μL之間，置于4 ℃的環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 MTHFR 的HRM基因分型

1.4.1設(shè)計(jì)引物 使用NCBI數(shù)據(jù)庫查詢MTHFR C677T SNP位點(diǎn)所在的DNA序列，結(jié)合Primer Premier5.0和Oligo6.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)：上游引物序列：GGAGAAGGTGTCTGCGGGAG；下游引物序列：CAAAGAAAAGCTGCGTGATGATGA。

1.4.2PCR反應(yīng) PCR擴(kuò)增選用10 μl體系，按要求配置好后封存待用。PCR的擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性時長3 min；95 ℃變性時長20 s，64.1 ℃復(fù)性時長20 s，72 ℃延伸時長4 s，再將第2-4步重復(fù)45個循環(huán)。

1.4.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的HRM分析 PCR流程完成后再72 ℃延伸1 min，95 ℃變性1 min，95℃復(fù)性1 min，重復(fù)2個循環(huán)，將產(chǎn)物移入到專用96孔掃面板中，在離心機(jī)內(nèi)以8 000 rpm的轉(zhuǎn)速離心5 min后取出產(chǎn)物，再將其放入Light Scanner儀中進(jìn)行高溫信號采集。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組研究對象的一般情況

本研究的4個實(shí)驗(yàn)組中研究對象的年齡和性別構(gòu)成無顯著差異，P>0.05。(見表1)

2.2 MTHFR C677TSNP位點(diǎn)哈迪溫伯格平衡檢驗(yàn)

將各實(shí)驗(yàn)組的MTHFR C677T基因多態(tài)性分布情況分別進(jìn)行哈迪溫伯格平衡檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)本研究所有SNP位點(diǎn)的基因型頻率均符合HWE(P>0.05)，說明本研究入組人群具有群體代表性。(見表2)

表1 各實(shí)驗(yàn)組研究對象年齡和性別構(gòu)成的比較

注：P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 MTHFR C677T基因多態(tài)性的哈迪溫伯格平衡分析

注：P>0.05，群體具有代表性。

2.3 各實(shí)驗(yàn)組MTHFR C677T基因的基因型和等位基因的分布

2.3.1各實(shí)驗(yàn)組 MTHFR C677T基因的基因型和等位基因的分布情況

MTHFR C677T基因多態(tài)性的基因型和等位基因在各組的分布情況結(jié)果見表3，通過觀察我們發(fā)現(xiàn)各組中MHTFR C677T基因的CT、TT基因型頻率及T等位基因頻率均高于對照組，CC基因頻率低于對照組。

2.3.2各實(shí)驗(yàn)組間MHTFR C677T基因的基因型與等位基因頻率的比較在顯性模型(CCv.s.CT+TT)中，我們將各組進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果見表3。與對照組相比，EH組CC基因型頻率低于對照組(18.63% vs.34.96%)，而CT、TT基因型頻率(50.98% 、30.39%)比對照組(44.95% 、20.18%)均高，且差異顯著，P=0.008；等位基因T頻率(55.88%)顯著高于對照組(42.66%)，P=0.007。HUA組CC基因型頻率(16.28%)顯著低于對照組(34.96%)，其CT、TT基因型顯著高于對照組(50%v.s.44.95% ，33.72%v.s.20.18%)，P=0.004；T等位基因頻率明顯高于對照組(58.72%vs.42.66%)，P=0.002。EH+HUA組CT、TT基因型顯著高于對照(51.57%、35.79%v.s.44.95%、20.18%)，CC基因型顯著低于對照組(12.63%v.s.34.96%)，P<0.001；T等位基因頻率(61.57%)明顯高于對照組(42.66%)，P<0.001。而各實(shí)驗(yàn)組間比較其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.0083。(見表3)

表3 顯性模型中各組MTHFR C677T基因的基因型和等位基因頻率分布及比較

注：4個組間指標(biāo)的兩兩比較，P需經(jīng)Bonferroni校正法校正，*P<α’=0.05/6=0.0083有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

EH及HUA都會增加心腦血管疾病不良事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，其存在高患病率、高致殘率、低知曉率、低治療率的現(xiàn)象，使其成為嚴(yán)重影響人們健康的慢性疾病[3,4]，當(dāng)二者并發(fā)時心腦血管疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)將大大增加[5-7]。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是人體內(nèi)促進(jìn)葉酸代謝的一個重要酶，MTHFR C677T基因有3個基因型，分別為CC、CT和TT，攜帶TT和CT基因型的人MTHFR酶活性會分別下降70%和30%[8]，從而影響Hcy的代謝，導(dǎo)致HHcy。

近年以來，國內(nèi)外已對高血壓及高尿酸血癥的相關(guān)基因做了許多研究，但是結(jié)果并不一致[9-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組中CT、TT基因型頻率及T等位基因頻率均高于對照組，CC基因頻率低于對照組，而在共病及單獨(dú)疾病中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這結(jié)果表明MTHFR C677等位基因可增加EH合并HUA、EH和HUA的患病風(fēng)險(xiǎn)，在EH或HUA患者中并不會增加患EH合并HUA共病的風(fēng)險(xiǎn)。EH和HUA均是多基因、多因素共同導(dǎo)致的復(fù)雜疾病，單基因研究尚不足以獲得陽性結(jié)果，需要進(jìn)一步深入的研究來探討其他基因多態(tài)性、以及基因之間的交互作用是否會導(dǎo)致差異性。有研究顯示MTHFR C677T基因檢測可用以指導(dǎo)高血壓精準(zhǔn)治療并取得更好的降壓效果[12,13]。而高尿酸血癥與原發(fā)性高血壓合并高尿酸血癥的基因研究指導(dǎo)疾病精準(zhǔn)治療的效果有待繼續(xù)研究。