賈晨光，劉豐勝，姚曉偉，高建國(guó)，白洪忠

(河北省胸科醫(yī)院骨科，河北 石家莊 050041)

我國(guó)為全球結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一,其中肺外結(jié)核病疫情嚴(yán)峻,而骨關(guān)節(jié)結(jié)核是危害較大的肺外結(jié)核病,其臨床表現(xiàn)復(fù)雜。目前臨床骨關(guān)節(jié)結(jié)核的早期診斷不容樂(lè)觀,相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道骨關(guān)節(jié)結(jié)核的誤診率高達(dá)78.26%。這與醫(yī)師對(duì)該病的認(rèn)知度低有關(guān)，同時(shí)也與骨關(guān)節(jié)結(jié)核臨床癥狀缺乏特異度、獲得細(xì)菌學(xué)及病理學(xué)困難、影像學(xué)檢查存在局限性等原因有關(guān)[1]。利福平耐藥熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)(Xpert Mtb/RIF)是近年來(lái)研發(fā)的一種快速、有效的分子生物學(xué)診斷技術(shù)。目前國(guó)內(nèi)外已將其應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷，具有較高的敏感度和特異度[2-3]。然而該技術(shù)在利福平耐藥和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)檢測(cè)中只有平均敏感度[4]。標(biāo)本的類(lèi)型是否會(huì)影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性尚無(wú)定論。為探討不同標(biāo)本類(lèi)型對(duì)Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果的影響，本研究觀察骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者病灶中膿液、干酪組織、肉芽組織、骨組織檢測(cè)的陽(yáng)性率，為術(shù)中選擇標(biāo)本提供依據(jù)，以提高骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷水平。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本收集 選取2016年6月—2019年6月在河北省胸科醫(yī)院骨科接受手術(shù)治療，且經(jīng)“臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)”最終確診的骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者245例，男性108 例，女性137例；年齡34～77歲，平均(52.2±12.2)歲。病灶部位：頸椎結(jié)核15例，胸椎結(jié)核42例，腰椎結(jié)核52例，骶椎結(jié)核21例，髖關(guān)節(jié)結(jié)核27 例，膝關(guān)節(jié)結(jié)核例38例，腕關(guān)節(jié)結(jié)核15例，手指結(jié)核8例，胸骨結(jié)核15例，骨盆結(jié)核 12例。所有患者均接受手術(shù)治療，術(shù)中收集膿液標(biāo)本199份、干酪樣組織標(biāo)本161份、肉芽組織標(biāo)本178份、骨組織標(biāo)本87份。其中有41例患者同時(shí)獲取了4種標(biāo)本。所有標(biāo)本分別進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、藥物敏感試驗(yàn)和Xpert MTB /RIF技術(shù)檢測(cè)。

1.2標(biāo)本處理 依照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]，將所有組織標(biāo)本徹底研磨，用N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉適當(dāng)清洗，3 000 r/min 離心20 min。干酪壞死組織、肉芽組織、骨組織加入適量磷酸鹽緩沖液后，應(yīng)用微型研磨器(Fast-prep24美國(guó)MP Biomedicals 公司)研磨，按組織的堅(jiān)韌度等調(diào)節(jié)設(shè)置按鈕，采用頻率為6.5 m/L，設(shè)置時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)為 20 s，振蕩2～3次形成勻漿，制成懸液，接種用。將標(biāo)本沉淀物均勻分為2個(gè)部分，分別用于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥物敏感試驗(yàn)和Xpert MTB/RIF系統(tǒng)檢測(cè)。

1.3結(jié)核分枝桿菌檢測(cè) 將標(biāo)本送至結(jié)核菌室行菌種鑒定及藥物敏感試驗(yàn)，用MGIT960自動(dòng)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)儀(美國(guó) BD公司生產(chǎn))進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)陽(yáng)性的樣本進(jìn)一步以最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)法 進(jìn)行結(jié)核藥物敏感試驗(yàn)。操作步驟參照《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[5]，具體藥物濃度檢測(cè)的上下限：乙胺丁醇(2.5～20 mg/L)、 克拉霉素(2.5～16 mg/L)、 異煙肼(0.2～1.6 mg/L)、利福平(1～8 mg/L)、鏈霉素(1～8 mg/L)、鹽酸左氧氟沙星(2～8 mg/L)、對(duì)氨基水楊酸異煙肼(0.1～1 mg/L)、丙硫異煙胺(10～40 mg/L)、阿米卡星(1～4 mg/L)、卷曲霉素(2.5～10 mg/L)、莫西沙星(0.5～2 mg/L)、利福布丁(0.75～3 mg/L)、環(huán)丙沙星(1～10 mg/L)、利福噴丁(0.75～3 mg/L)、克拉霉素(15～25 mg/L)、對(duì)氨基水楊酸(2～8 mg/L)、氯法齊明(2～8 mg/L)、利福噴丁(0.5～2 mg/L)。

1.4Xpert MTB/RIF 檢測(cè) 將標(biāo)本同時(shí)送分子生物學(xué)試驗(yàn)室行 Xpert MTB/RIF 檢測(cè)(美國(guó)Cepheid公司)。根據(jù)Xpert MTB/RIF應(yīng)用手冊(cè)，將各冰凍病灶標(biāo)本解凍后，各取1 mL標(biāo)本沉淀物加入2 mL樣本處理液，劇烈震蕩20次，室溫孵育10 min；再次振蕩，室溫孵育5 min，使用新的移液管，將2 mL樣本加入試劑匣，將標(biāo)本置4通道Gene Xpert平臺(tái)進(jìn)行自動(dòng)操作，約2 h后將樣品加入盒子，系統(tǒng)可以自動(dòng)讀取測(cè)試結(jié)果和利福平耐藥結(jié)果。

1.5臨床診斷標(biāo)準(zhǔn) 英國(guó)國(guó)家衛(wèi)生醫(yī)療質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)署于2011年制定的結(jié)核病診療與防控指南中“骨結(jié)核臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)”[6]：①結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性；②病理結(jié)果回報(bào)結(jié)核性肉芽腫，干酪樣壞死；③影像學(xué)表現(xiàn)典型骨結(jié)核；④抗結(jié)核藥物治療有效。上述任何一項(xiàng)符合即臨床診斷為“骨結(jié)核”。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。以結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥物敏感試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算Xpert MTB/RIF檢測(cè)的敏感度和特異度。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽(yáng)性率比較 245例患者中結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性112例，陽(yáng)性率為45.71%。625份標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性213份，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性率比較膿液>干酪組織>肉芽壞死組織>骨組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。245例患者中Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽(yáng)性128例，陽(yáng)性率為52.24%。625份標(biāo)本中Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽(yáng)性255份，Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽(yáng)性率比較膿液>干酪組織>肉芽組織>骨組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。2種方法聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性185例，陽(yáng)性率為75.51%。Xpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)檢驗(yàn)?zāi)撘?、肉芽組織、干酪組織、骨組織陽(yáng)性率均高于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 2種檢測(cè)方法及不同標(biāo)本陽(yáng)性率比較Table 1 Comparison of two detection methods and positive rates of different specimens (例數(shù)，%)

2.2Xpert MTB/RIF檢測(cè)診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核的敏感度和特異度 Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核的敏感度為96.43%，特異度為84.96%。見(jiàn)表2。

表2 Xpert MTB/RIF檢測(cè)診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核的敏感度和特異度Table 2 Sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF assay (例數(shù))

2.3Xpert MTB/RIF檢測(cè)診斷利福平耐藥的敏感度和特異度 112例培養(yǎng)陽(yáng)性患者中Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)診斷利福平耐藥的敏感度為97.92%，特異度為93.75%。見(jiàn)表3。

表3 Xpert MTB/RIF檢測(cè)利福平耐藥的敏感度及特異度Table 3 Sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF for detecting rifampicin resistance (例數(shù))

3 討 論

抗結(jié)核藥物在治療骨關(guān)節(jié)結(jié)核病的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。隨著全球耐藥結(jié)核病例數(shù)逐漸增多，特別是多重耐藥及廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)結(jié)核的治療正面臨巨大挑戰(zhàn)[7]。早期診斷并進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)指導(dǎo)下的個(gè)體化治療是治療耐藥結(jié)核的關(guān)鍵，否則可能導(dǎo)致獲得性耐藥以致需要更長(zhǎng)時(shí)間的治療周期。目前常規(guī)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥物敏感試驗(yàn)通常需要幾周至數(shù)月時(shí)間才能完成結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥物敏感試驗(yàn)，且陽(yáng)性率從10%～60%不等[8]。在此期間，經(jīng)驗(yàn)性抗結(jié)核化療可能會(huì)導(dǎo)致獲得性耐藥。迫切需要開(kāi)展快速、準(zhǔn)確、高效率的方法用于骨關(guān)節(jié)結(jié)核診斷及耐藥性檢測(cè)。骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷包括影像學(xué)檢測(cè)、病理學(xué)檢測(cè)和病原微生物學(xué)檢測(cè)，且長(zhǎng)期以來(lái)骨關(guān)節(jié)結(jié)核的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性率較低[9]。

目前基于分子生物學(xué)PCR技術(shù)的Xpert MTB/RIF分子診斷技術(shù)是一種快速、有效的診斷結(jié)核感染的方法。Xpert MTB/RIF技術(shù)是通過(guò)整合核酸準(zhǔn)備、擴(kuò)增、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的完全自動(dòng)化檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥技術(shù)[10]。其最大程度簡(jiǎn)化結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)，且不受非結(jié)核分枝桿菌影響，將結(jié)核分枝桿菌液體培養(yǎng)系統(tǒng)至少3周才能完成的培養(yǎng)及利福平耐藥檢測(cè)縮短為2 h，操作簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠，對(duì)操作者和周?chē)h(huán)境安全，在肺結(jié)核痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)中敏感度為95.8%，特異度為98.4%，檢測(cè)利福平耐藥的敏感度為93.33%，特異度為94.12%[6]。目前該技術(shù)已經(jīng)用于骨關(guān)節(jié)結(jié)核檢測(cè)，但是目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)其對(duì)結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的特異度較高，敏感度一般，標(biāo)本類(lèi)型及處理會(huì)影響其檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率呢？目前，關(guān)于不同類(lèi)型組織標(biāo)本的檢測(cè)差異的研究和報(bào)告缺乏[11]。

為探討如何選擇標(biāo)本類(lèi)型，以提高該技術(shù)的陽(yáng)性率，本研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合不同類(lèi)型標(biāo)本(包括膿液、肉芽組織、干酪組織、骨組織中1種或以上標(biāo)本)，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性率為45.71%，Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽(yáng)性率為52.24%，聯(lián)合檢測(cè)為陽(yáng)性率75.51%。有研究表明，臨床醫(yī)生在骨關(guān)節(jié)結(jié)核手術(shù)中，應(yīng)盡量留取多種標(biāo)本并在條件允許情況下開(kāi)展聯(lián)合檢測(cè)，有利于提高總體陽(yáng)性率，將對(duì)骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷大有裨益，對(duì)縮短診斷時(shí)間亦有積極意義[12]。在膿液、肉芽組織、干酪組織、骨組織標(biāo)本中，Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)的陽(yáng)性率均高于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，表明Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)比結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)更適用于骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者的標(biāo)本檢測(cè)。以結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和藥物敏感試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF檢測(cè)診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核的敏感度為96.43%，特異度為84.96%，診斷利福平耐藥的敏感度為97.92%，特異度為93.75%。因骨關(guān)節(jié)結(jié)核手術(shù)中病灶標(biāo)本取材質(zhì)地不同、含菌量不同、前期處理方式不同，分子診斷技術(shù)的陽(yáng)性率與不同類(lèi)型標(biāo)本的質(zhì)地及含菌量相關(guān)，為進(jìn)一步提高早期診斷的陽(yáng)性率，有必要對(duì)病灶內(nèi)不同類(lèi)型組織標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)陽(yáng)性率進(jìn)行比較[13]。 本研究結(jié)果顯示，無(wú)論是Xpert MTB/RIF檢測(cè)還是結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，陽(yáng)性率均為膿液>肉芽組織>干酪組織>骨組織，表明早期在超聲或CT引導(dǎo)下穿刺膿腫，進(jìn)行膿液結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)可獲得陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)。不同類(lèi)型的標(biāo)本進(jìn)行Xpert MTB/RIF檢測(cè)和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，可確定結(jié)核感染和評(píng)估其耐藥性，進(jìn)行有效治療[14]。病灶中盡量取多種類(lèi)型標(biāo)本，進(jìn)行Xpert MTB/RIF及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)聯(lián)合檢測(cè)，可明確結(jié)核分枝桿菌感染并且評(píng)估其耐藥性，早期開(kāi)展有效的抗結(jié)核化療。

各種標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性率差異的原因?yàn)椋汗顷P(guān)節(jié)結(jié)核病變發(fā)展早期，由于菌量多，機(jī)體處于較強(qiáng)變態(tài)反應(yīng)期，組織器官中血管的滲透性較高，炎性介質(zhì)及蛋白質(zhì)向血管外滲出，此時(shí)處于以滲出為主的膿液性病理表現(xiàn)，主要表現(xiàn)為漿液性、纖維蛋白炎性滲出，經(jīng)過(guò)滲出、壞死、增生變化逐漸形成結(jié)核性肉芽組織及干酪壞死物，干酪物質(zhì)軟化，最后液化形成結(jié)核性膿腫。在病理過(guò)程的不同階段，結(jié)核分枝桿菌濃度分布情況不同[15-17]。應(yīng)收集不同類(lèi)型的脊柱結(jié)核標(biāo)本，特別是膿液，采用Xpert MTB/RIF測(cè)定以提高診斷率。隨著耐藥結(jié)核病患者數(shù)量增加有必要改變現(xiàn)有的檢測(cè)系統(tǒng)，擴(kuò)大基因檢測(cè)的覆蓋范圍，以開(kāi)展完整的評(píng)估。

傳統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥物敏感試驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)，延誤其對(duì)臨床的指導(dǎo)價(jià)值。新興的一些分子生物學(xué)GeneXpert檢測(cè)技術(shù)，能夠進(jìn)行快速藥物敏感診斷而深受臨床歡迎。未來(lái)開(kāi)展新的分子診斷技術(shù)時(shí)，可以適當(dāng)選擇在術(shù)中取得組織來(lái)進(jìn)行有效檢測(cè)，以早期獲得藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果，及時(shí)發(fā)現(xiàn)耐藥，調(diào)整治療方案，減少術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生。

總之，對(duì)于骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者，術(shù)中優(yōu)先選擇膿液送檢，盡量送檢多種標(biāo)本以提高陽(yáng)性率。