陳洪江，羅紹偉，林海明，許建坤，黃鐘煉，黃澤彬，陳潔斌，許偉才，胡軍

(汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院骨科，廣東汕頭 515000)

自上世紀90年代，Haupt等[1]首先發(fā)現(xiàn)體外沖擊波(Extracorporeal Shock Wave，ESW)可促進骨折愈合，此后，ESW已被證實可有效治療骨折延遲愈合或不愈合，其治愈率達70%。

骨折愈合需要多種細胞協(xié)調(diào)參與，包括骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)。MSCs作為一種多能干細胞，能分化產(chǎn)生骨、軟骨、肌腱、脂肪及肌肉等肌肉骨骼組織[4]。在骨折愈合早期炎癥反應中，基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)從破壞的骨組織中釋放并募集骨膜及髓腔中的MSCs 至骨折區(qū)域，分化形成骨痂[6]。SDF-1即趨化因子CXCL12，廣泛表達于多種細胞，如成骨細胞[7]、骨膜細胞[8]及骨髓、脂肪來源的間充質(zhì)干細胞，且以自身反饋形式促進MSCs 存活、增殖及分化[10]。

MSCs能表達一系列趨化因子受體，其中趨化因子受體4(CXCR4)即CXCL12的配體，被廣泛證實與MSCs 遷移相關(guān)[11]。ESW對骨髓MSCs的粘附、遷移、增殖、分化具有促進作用，有研究表明MSCs 的粘附、分化能力相互影響，MSCs 粘附得越多則其成骨分化能力越強。MSCs分泌的SDF-1及表達的CXCR4受體能相互促進MSCs向目標骨組織遷移。

本研究將在前期研究的基礎(chǔ)上，探討適宜能量沖擊波促進MSCs向成骨分化過程中SDF-1/CXCR4的作用，為沖擊波更廣泛應用于骨科疾病臨床治療提供更全面的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取24只4周齡雄性SD大鼠作為骨髓MSCs來源，選取48只12周齡雄性SD大鼠用于體內(nèi)試驗，其外觀及反應均良好。動物均采購并飼養(yǎng)于汕頭大學醫(yī)學院試驗動物中心。動物的飼養(yǎng)和試驗方案遵守中國試驗動物管理條例(衛(wèi)生部第55號文件)及汕頭大學醫(yī)學院動物試驗指南。

1.2 大鼠骨髓MSCs的培養(yǎng)及鑒定

取4周雄性SD大鼠以頸椎脫位處死，浸泡于75%酒精中5 min后移入超凈工作臺中，分離雙側(cè)股骨及脛骨并仔細剔除軟組織與骨膜，用PBS漂洗3次，然后用無菌注射器抽取完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的αMEM培養(yǎng)基)反復沖洗骨髓腔，收集沖洗液離心并用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞數(shù)為1×106/mL后接種于培養(yǎng)瓶中，于37℃、標準濕度、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，72 h后半量換液，以后隔3 d全量換液。當細胞達到90%融合度時，用0.25%胰蛋白酶消化，按照1：3比例傳代至第3代細胞以供實驗使用[15]。將獲得的第3代細胞用成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)21 d后，用茜素紅染色鑒定其成骨分化能力；用成脂誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后，用油紅染色法鑒定其成脂分化的能力。

1.3 體外試驗分組及大鼠間充質(zhì)干細胞的體外沖擊波處理

體外試驗分空白對照組(Ctrl組)、沖擊波組(ESW組)及CXCR4特異抑制劑AMD3100組(AMD組)[16]。取第3代MSCs，與AMD3100 共培養(yǎng)24 h后，經(jīng)沖擊波處理作為AMD組細胞；ESW組細胞僅接受沖擊波處理；Ctrl組細胞未經(jīng)任何處理。各組細胞經(jīng)處理供后續(xù)使用，調(diào)整細胞密度至1×106/mL后，接種0.5 mL于6孔板，每組實驗每時間點設(shè)置3復孔供茜素紅染色、堿性磷酸酶染色及SDF-1蛋白分泌定量實驗使用。

沖擊波處理方法：以0.25%胰蛋白酶消化，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至1×106/mL，取1.5 mL細胞懸液置于15 mL無菌聚丙乙烯管內(nèi)，使用本院泌尿外科惠康VI 型液電式體外沖擊波碎石機(惠康VI 型，深圳)，采用間接定位法確定體外沖擊波焦點，將聚乙烯管尖底部含細胞懸液部分充分固定于預先均勻涂抹有耦合劑的球囊壁，按照課題組前期運用MTT法確定體外沖擊波適宜能量(500脈沖次數(shù)、10 kV)進行體外第三代沖擊波處理用于后續(xù)實驗。

1.4 茜素紅染色

當Ctrl組細胞達到100%融合度時，各組細胞進行成骨誘導培養(yǎng)，于第5、10、15、20天進行染色及定量分析。染色方法：吸凈培養(yǎng)基，PBS漂洗3遍，用95%酒精固定15 min，蒸餾水漂洗3 遍，然后加入1% 茜素紅染色液2 mL置室溫孵育10 min，蒸餾水飄洗后自然條件下干燥，然后顯微鏡下觀察并拍照記錄。茜素紅染色后量化的方法：將被染成深紅色的礦化鈣結(jié)節(jié)用1 mol/L的HCl溶液溶解后，通過測量在590 nm波長的吸光度，對礦化鈣結(jié)節(jié)進行量化分析。

1.5 堿性磷酸酶染色

當Ctrl組細胞達到100%融合度時，各組細胞進行成骨誘導培養(yǎng)，于第5、10、15、20天進行染色及定量分析。染色方法：吸凈培養(yǎng)基，PBS飄洗3遍，0.4%多聚甲醛固定10 min，PBS再次沖洗2遍并吸凈殘余液體。按照試劑盒說明書配制孵育工作液(堿性磷酸酶顯色緩沖液∶BCIP∶NBT= 300∶1∶2)，每個6孔板加入1 mL工作液，室溫避光孵育直至顯色至預期深淺，吸去工作液并用蒸餾水漂洗終止顯色反應，自然條件下干燥后掃描記錄。

堿性磷酸酶的定量測定：各組細胞分別于第5、10、15、20天更換新鮮培養(yǎng)基，并于24 h后取上清液，按試劑盒操作說明在酶標板上分測定孔、3孔標準孔及3孔空白孔，每測定孔加入各組細胞上清液5 uL，每標準孔加入濃度為0.1 mg/mL酚標準液5 uL，每空白孔加入雙蒸水5 uL。每孔繼續(xù)加入緩沖液50 uL、基質(zhì)液50 uL，充分混勻后，將酶標板置于37 ℃水浴15 min，各孔加入顯色劑150 uL，輕輕振搖孔板均勻，在波長520 nm下，酶標儀測定各孔吸光度。測定后計算堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)含量,公式如下:ALP(金氏單位)=(測定孔吸光度-空白孔吸光度)/(標準孔吸光度-空白孔吸光度)×酚標準液濃度×100 mL,金氏單位定義:100 mL液體在37 ℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個金氏單位。

1.6 體外沖擊波促進SDF-1分泌

經(jīng)處理后4、8、12、24 h收集各組培養(yǎng)基，采用雙抗體夾心ELISA法，用抗大鼠SDF-1單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的SDF-1與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠SDF-1，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，在450 nm處測吸光度(OD)，SDF-1濃度與OD值成正比，通過繪制標準曲線求出標本中SDF-1濃度。

1.7 動物模型制作及X線檢查

采用48只12周齡雄性SD大鼠制作右側(cè)股骨骨缺損模型，隨機分成Ctrl、ESW及AMD 3組各16只(術(shù)后第4、8周各8只)，PLGA支架置于各組細胞懸液(1×106/mL)中的培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后備用。采用右側(cè)股骨中段骨缺損模型，各組骨缺損處植入載有該組細胞的PLGA支架，AMD組術(shù)后接受AMD3100注射(1 mg/kg/day)，于術(shù)后第4、8周取材。

模型制作方法：用1.5 %戊巴比妥鈉(1 mL/kg)腹腔注射麻醉，備皮并用碘酒及酒精消毒，打開膝關(guān)節(jié)腔后，從膝關(guān)節(jié)面置入合適大小的克氏針以獲得穩(wěn)定固定，分離右側(cè)股骨后，用鋼銼將右股骨中段銼出5 mm長、1/2周徑的骨缺損，置入PLGA支架。術(shù)后使用X線檢查模型是否成功，切口定期換藥，連續(xù)3 d抗生素肌肉注射預防感染，AMD3100 融于生理鹽水(濃度1 mg/mL)對AMD組大鼠進行腹腔注射(1 mg/kg/day)，余2組注射等量空白生理鹽水。

1.8 Micro-CT評估新形成骨情況

于術(shù)后第4 周和第8 周，頸椎脫位處死大鼠獲取右股骨標本，取出克式針并剔除非缺損處的軟組織，用10%福爾馬林固定24 h后，置于micro-CT設(shè)備中掃描整個骨缺損區(qū)后供H-E染色及免疫組化使用

1.9 H-E染色及免疫組化

于術(shù)后第4、8 周拉頸處理大鼠，取右側(cè)股骨剔除肌肉，經(jīng)10%福爾馬林溶液固定24 h、10%EDTA脫鈣6周及乙醇梯度脫水等處理后，進行石蠟連續(xù)切片(厚5 μm)，隨后通過H-E染色計算新生類骨質(zhì)相對面積評估骨缺損愈合情況，按照免疫組化試劑盒分析骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)表達。

1.10 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，方差分析法(ANOVA)用于進行多組均數(shù)的比較，t檢驗用于分析兩組之間各種均數(shù)的比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠間充質(zhì)干細胞形態(tài)及分化鑒定

從骨髓中獲取貼壁成長的細胞，在倒置顯微鏡下100倍鏡觀察可見細胞呈紡錘形、長梭形等形態(tài)，大小形態(tài)均一并呈集落生長[圖1(a)]。MSCs經(jīng)成骨分化誘導3周后，肉眼可見大小不等的灰白色結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)經(jīng)茜素紅染色后呈現(xiàn)深紅色，說明其具有良好的成骨分化能力[圖1(b)]；MSCs經(jīng)成脂分化誘導10 d后，鏡下可見細胞內(nèi)有脂滴形成，經(jīng)油紅染色后呈紅色，說明其具有良好的成脂分化能力[圖1(c)]。結(jié)果顯示，MSCs具有良好的多向分化潛能。

2.2 茜素紅染色、ALP染色及分泌SDF-1測定

將Ctrl組、AMD組及ESW組的MSCs培養(yǎng)至Ctrl組細胞融合后，進行成骨誘導(第5、10、15、20天)，分別進行茜素紅染色及ALP染色，并對染色結(jié)果進行定量分析。從圖2(a)結(jié)果可以看出，ESW組的鈣結(jié)節(jié)染上茜素紅的顏色明顯深于Ctrl組及AMD組，表現(xiàn)了明顯的成骨能力；ESW組大部分貼壁細胞的胞漿及胞外基質(zhì)被染成藍紫色的顏色明顯深于Ctrl組及AMD組，表現(xiàn)了強烈的ALP活性。從定量分析結(jié)果也可以看到[圖2(b)-(c)]，ESW組在各個時間點(第5、10、15、20天)的茜素紅吸光度及ALP活性染色明顯高于其他實驗組。而ALP和鈣含量測定分別是成骨分化的早期和晚期的定量分析標志性指標，這些結(jié)果進一步驗證了ESW效應促進MSCs 成骨分化作用明顯增強，而這種增強效果可以被CXCR4受體拮抗劑AMD3100所部分抑制，僅存少許對MSCs成骨分化的作用。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定SDF-1分泌型蛋白表達設(shè)置3個復孔，重復3次。如圖2(d)結(jié)果示ESW組SDF-1分泌量較Ctrl、AMD組呈現(xiàn)顯著增高，隨著時間推移，SDF-1表達量在不同時間點均逐漸增多，且統(tǒng)計學有統(tǒng)計意義(4h時P<0.05；8、12 h時P<0.05；24h時P<0.001)。

2.3 大鼠骨缺損模型及骨愈合的Micro-CT 3D重建

選取外觀及反應良好的12周齡雄性SD大鼠制造右側(cè)股骨干1/2骨缺損模型[圖3(a)]，將PLGA支架植入大鼠骨缺損部位[圖3(b)]，術(shù)后進行X線檢查，了解股骨是否存在骨折及骨缺損情況，X線片顯示各組骨缺損克氏針內(nèi)固定情況良好以及骨缺損區(qū)域的骨缺損制作良好[圖3(c)]，白色箭頭指示骨缺損部位)。將各組股骨樣品收集起來，固定并行Micro-CT掃描。三維CT清晰顯示[圖3(d)]，PLGA支架植入的ESW組中，術(shù)后4周，支架附于骨缺損局部有骨痂形成，而Ctrl組及AMD組骨缺損部位邊緣較銳且局部未見明顯骨痂形成；術(shù)后8周時，支架植入的ESW組骨缺損部位均有豐富的骨痂形成，部分缺損區(qū)充滿了礦化骨痂，而Ctrl組及AMD組僅有少量礦化骨附于骨缺損邊緣。進一步對CT掃描骨體積分數(shù)進行統(tǒng)計分析[圖3(e)]，結(jié)果提示PLGA支架植入的ESW組，較Ctrl組及AMD組明顯有更多的新生骨形成并有統(tǒng)計學意義，提示ESW對骨缺損的愈合具有明顯的促進作用。

2.4 H-E染色及骨形成蛋白的免疫組化檢測

Ctrl組、AMD組及ESW組分別于4、8周后對大鼠股骨進行取材、固定、脫鈣、切片，通過H-E染色觀察骨缺損部位的組織修復情況。染色結(jié)果顯示，在4周和8周，隨著支架的降解，ESW組比Ctrl組及AMD組明顯有更多的類骨質(zhì)組織形成；H-E染色結(jié)果[圖4(a)]及統(tǒng)計分析結(jié)果[圖4(b)]從組織學角度同樣表明，ESW具有可促進骨缺損愈合的治療效果。

進一步通過免疫組化檢測Ctrl組、AMD組及ESW組的骨缺損愈合區(qū)域組織中OPN表達情況[圖4(c)]，結(jié)果顯示ESW組在兩個時間點骨缺損部位OPN的表達量明顯高于Ctrl組及AMD組，對骨缺損區(qū)域骨愈合中的OPN的光密度統(tǒng)計分析[圖4(d)]同樣顯示ESW組優(yōu)于Ctrl組及AMD組，且有統(tǒng)計學意義；OPN免疫組化染色的結(jié)果，其表達趨勢與H-E染色結(jié)果保持一致，進一步表明ESW效應對骨缺損區(qū)域骨愈合的促進作用。

3 討論

在本研究開展前，前期相關(guān)研究表明ESW具有促進骨髓間充質(zhì)干細胞的粘附及成骨分化作用，其推斷基礎(chǔ)之一就是間充質(zhì)干細胞粘附、分化等生物行為之間存在相互聯(lián)系。已有研究利用原子力顯微鏡研究分析細胞骨架、粘附能力及其分化方向之間的關(guān)系，得到如下結(jié)論：具有結(jié)實及平鋪的肌動蛋白骨架即粘附能力強的MSCs成骨分化趨勢更明顯，而具有圓球形、松散的激動蛋白細胞骨架即粘附能力弱的MSCs成脂及成軟骨分化趨勢顯著。因此，如果一個特定的機械力可以誘導成骨細胞分化的MSCs，將可能促進MSCs的粘附。本研究團隊早期發(fā)現(xiàn)ESW促進大鼠成骨細胞的黏附、遷移和成骨分化能力[18]，結(jié)合筆者所獲得的結(jié)果，即ESW作用能夠促進MSCs粘附的研究發(fā)現(xiàn)，則再一次說明了細胞生物行為之間的聯(lián)系。

本實驗股骨半缺損模型中應用的PLGA具有很好的生物相容性，PLGA在此模型中提供了細胞支架作用，MSCs治療的首要基礎(chǔ)是其細胞的粘附及遷移，因此在PLGA提供細胞支架的基礎(chǔ)上可以大大利于MSCs向骨缺損區(qū)域的定向粘附與遷移，通過ESW組相對Ctrl組具有明顯促進MSCs向成骨分化的作用，在組織學層面可以觀察到在骨缺損區(qū)有明顯類骨質(zhì)的骨痂形成；將PLGA制成具有容納MSCs孔隙的3D立體支架，在體外加載MSCs并進行體外ESW處理，隨后植入骨缺損處，這種支架結(jié)合了材料和處理方法在成骨方面的優(yōu)點，是一種可通過體外預處理干細胞提高干細胞治療療效及應用于骨折缺損修復的恰當策略，本研究豐富了其應用的基礎(chǔ)理論，并說明了該策略的可能性及可行性。

圖1 (a)MSCs(3代)100 倍鏡下觀察，可見細胞貼壁生長，呈長梭形、紡綞形等形態(tài)，成集落樣生長；(b)MSCs(3代)經(jīng)成骨分化誘導后經(jīng)茜素紅染液染色，可見許多鈣結(jié)節(jié)被染成深紅色(白色箭頭)；(c)MSCs(3代)經(jīng)成脂誘導10 d后進行油紅染色，可見許多被油紅染成紅色的脂滴(白色箭頭)。

圖2 (a)成骨誘導20 d后，茜素紅染色及堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示ESW組的鈣結(jié)節(jié)染上茜素紅顏色明顯深于Ctrl組及AMD組；(b)Ctrl組、AMD組及ESW組深紅色的礦化鈣結(jié)節(jié)及測量吸光度(590 nm波長)，對不同時間點的礦化鈣沉積進行量化分析。(c)Ctrl組、AMD組及ESW組細胞檢測不同時間點的ALP活性定量值數(shù)據(jù)；(d)Ctrl、AMD及ESW三組在4、8、12及24 h的MSCs分泌SDF-1量分析，ESW在24 h相對Ctrl組、AMD組有統(tǒng)計差異(P<0.01及P<0.05)；(n=3；*代表ESW組與 Ctrl組及AMD組比較的P 值，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

圖4 (a)Ctrl組、AMD組及ESW組的骨缺損區(qū)域骨愈合的組織切片H-E染色；(b)Ctrl組、AMD組及ESW組的骨缺損區(qū)域骨愈合的類骨質(zhì)相對面積的統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示ESW組類骨質(zhì)組織的表達明顯高于Ctrl組及AMD組，且有統(tǒng)計學意義。(c)Ctrl組、AMD組及ESW組的骨缺損區(qū)骨愈合的OPN免疫組化表達情況；(d)Ctrl組、AMD組及ESW組的骨缺損區(qū)OPN蛋白表達的平均光密度統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示ESW組優(yōu)于Ctrl組及AMD組，且有統(tǒng)計學意義。(n=5；*代表其他實驗組與對照組比較的P值，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

骨髓MSCs自身表達SDF-1，且在體外無干涉因素條件下，MSCs有自身遷移的能力。有研究闡明，SDF-1通過自身反饋促進自身的增殖、存活、成骨分化[10]，能夠誘導MSCs粘附。低能量剪切力通過增加SDF-1的分泌，以自身反饋的形式增加CXCR4的表達，從而促進MSC的遷移；低頻率超聲與體外沖擊波對于骨折愈合作用具有相似之處，均通過促進SDF-1的局部表達實現(xiàn)作用。而以上的ESW促進效應可以被CXCR4受體抑制劑AMD3100明顯抑制，如AMD組在骨缺損區(qū)域中的類骨質(zhì)形成較ESW組減少，結(jié)合本研究結(jié)果可充分說明，SDF-1及CXCR4受體在ESW促進骨愈合作用過程中具有重要作用。

局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是在細胞粘附、遷移及存活功能中起重要作用的信號分子[23]。FAK在骨骼生長中起到機械傳導的作用，亦通過多種處理方式介導遷移的信號通路。MSCs向腫瘤細胞條件培養(yǎng)基的遷移機制之一，即為SDF-1誘導FAK的激活。基于以上分析，ESW對MSCs粘附、遷移的促進作用，除與SDF-1的自身分泌增加有關(guān)外，很可能亦與FAK的表達增加有關(guān)，筆者對其機制的研究還處于初步階段，有待進一步探索證明。