摘 要 以不同連（輪）作年限種植白肉靈芝的溫室土壤為實驗材料，研究不同連（輪）作年限土壤真菌多樣性的變化趨勢。通過高通量測序技術(shù)并結(jié)合相關(guān)生物信息學(xué)方法，分析土壤中真菌ITS1+ITS2區(qū)域的豐富度、多樣性指數(shù)以及群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，連作或輪作后均能夠提高微生物群落多樣性，子囊菌門、擔(dān)子菌門及接合菌門為優(yōu)勢真菌，擔(dān)子菌門的比例隨連作年限的增加而逐漸增加，輪作后豐度降低。

關(guān)鍵詞 白肉靈芝;真菌;多樣性

中圖分類號：S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.09.093

土壤中的微生物主要通過吸收和轉(zhuǎn)化的途徑影響?zhàn)B分的利用，而造成土壤營養(yǎng)水平低下及產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)量下降的原因則可能是微生物種群發(fā)生了變化[1]。產(chǎn)品連作年限較久會造成土壤中微生物種群結(jié)構(gòu)單一化，從而造成土壤質(zhì)量直線下降，土壤pH發(fā)生變化甚至于造成產(chǎn)品產(chǎn)量大減或者絕收。而造成產(chǎn)品減產(chǎn)的原因則主要是真菌，如尖孢鐮刀菌、疫霉屬及炭疽菌屬等致病真菌。基于此，從真菌數(shù)量、種類等方面，研究連作和輪作對土壤中真菌多樣性的影響，為連作障礙提供理論依據(jù)[2-3]。

1 材料與方法

1.1 時間與地點

試驗于2019年3—8月在西藏自治區(qū)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)示范園區(qū)溫室大棚進(jìn)行。

1.2 試驗材料

5個相鄰的溫室：1）多年未種植白肉靈芝;2）連作白肉靈芝2年;3）連作白肉靈芝2年后輪作種植羊肚菌;4）連作白肉靈芝3年后輪作種植蒜苗;5）連作白肉靈芝3年后換土。

試劑盒：E.Z.N.A.?Soil DNA Kit。

1.3 取樣及保存

5個溫室分別在白肉靈芝未種植及種植后分時間段采取土壤樣品于-20℃冷凍保存。

1.4 試驗方法

1.4.1 土壤微生物基因組DNA的提取

稱取0.5 g于-20 ℃保存的土壤樣品，按試劑盒的試驗步驟進(jìn)行微生物總DNA的提取，DNA樣品于-20 ℃保存待用。

1.4.2 試驗流程

提取樣品總DNA后，根據(jù)設(shè)計得到真菌ITS1+ITS2合成的引物，合并引物接頭，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系：含15 mmol·L-1 MgCl2的10×Buffer 10.0 μL，2.5 mmol·L-1 dNTPs 2.0 μL，10 μmol·L-1引物各5.0 μL，5 U·μL-1Taq酶1.0 μL，DNA模板4.0 μL，滅菌去離子水73.0 μL，總體積100 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán);72 ℃ 10 min。

文庫建立：對產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進(jìn)行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用HiSeq PE250進(jìn)行檢測，由聯(lián)川生物技術(shù)公司完成測序[4]。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均采用Excel和SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同連作年限土壤真菌OTU聚類分析

將所有樣品的有效序列進(jìn)行聚類，按照97%的序列相似度將這些序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units），得到每個Cluster的序列及其代表序列（即為OTU），用于統(tǒng)計每個OTU序列和豐度進(jìn)行下游分析[5]。

由圖1的Venn圖可知，1號溫室總OTUs為448，2號溫室總OTUs為1 390，3號溫室總OTUs為1 211，4號溫室總OTUs為925，5號溫室總OTUs為421;5個樣品中共有的OTUs個數(shù)有143個，其中2號溫室特有OTUs個數(shù)最多，達(dá)到240個（因5號溫室置換土壤過程中導(dǎo)致數(shù)據(jù)異常，不再對其進(jìn)行后續(xù)分析）。

2.2 不同連作年限土壤真菌Alpha多樣性分析

Alpha多樣性也稱為生境內(nèi)物種多樣性[6]，包括Chao1、Observed_species、Goods_coverage、Shannon和Simpson指數(shù)。利用Alpha多樣性分析方法，對土壤樣品中的OTUs總數(shù)和Chao1指數(shù)進(jìn)行分析，可得出連作土壤中真菌的多樣性變化及數(shù)值[7]。不同年限連（輪）作下土壤真菌Alpha多樣性的結(jié)果如表1所示。

由表1可知，在白肉靈芝生長過程中，輪作及連作土壤中真菌的OTUs總數(shù)及Chao1指數(shù)均高于未種植靈芝溫室;連作后輪作的品種對溫室土壤真菌群落OTUs總數(shù)及Chao1指數(shù)有一定的影響。通過Alpha多樣性分析可知，連作與輪作均能夠提高微生物群落多樣性。

2.3 不同連作年限土壤真菌群落門類組成物種分析

2.3.1 不同連作年限土壤真菌物種分類統(tǒng)計

根據(jù)物種豐度表，選取豐度最高的20個物種分類，進(jìn)行相對豐度計算，獲得相對豐度數(shù)據(jù)，繪制樣品豐度柱狀圖，便于更直觀地進(jìn)行樣品豐度比較[8-9]。圖2和圖3中橫軸為樣品名稱，每個樣品3個重復(fù)，縱軸代表門及屬的相對豐度;不同顏色對應(yīng)不同物種。由圖2門級別柱狀圖可以看出各溫室土壤中占比最高的真菌為子囊門（Ascomycota），其次分別為擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和接合菌門（Zygomycota）;連作增加了擔(dān)子菌門的相對豐度，輪作降低了擔(dān)子菌門的相對豐度，卻增加了接合菌門的相對豐度。由圖3屬級別柱狀圖可以看出2、3、4號溫室中內(nèi)生菌屬（Phialocephala）含量較多，1號溫室內(nèi)生菌屬含量較少;木霉屬（Hypocrea）在各溫室土壤中含量較高;煙色織孢霉屬（Plectosphaerella）在2、4號溫室含量較高，1、3號溫室含量較少;透孢黑團(tuán)殼屬（Massarina）在2、3號溫室含量較高，4號含量較少，1號溫室沒有;靈芝屬（Ganoderma）除了1號溫室沒有外，在2、3、4均有存在。

3 結(jié)論

通過微生物測序技術(shù)得出白肉靈芝輪作和連作土壤樣品中真菌的門、屬類別及豐度，發(fā)現(xiàn)連作或輪作后均能夠提高微生物群落多樣性，子囊菌門、擔(dān)子菌門及接合菌門為優(yōu)勢真菌，擔(dān)子菌門的比例隨連作年限的增加而逐漸增加，輪作后豐度降低，但接合菌門的相對豐度增大。但是仍有很大一部分類別真菌物種尚未鑒定出，尤其是屬級別真菌，所以需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究探討和鑒定。

參考文獻(xiàn)：

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（責(zé)任編輯：趙中正）

收稿日期：2020-01-15

基金項目：西藏白肉靈芝連（輪）作下土壤生物相關(guān)性研究（XZ2017ZRG-39）;國家食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系拉薩綜合試驗站課題（CARS-20-95）;科技富民穩(wěn)邊專項-西藏特色食用菌高效栽培技術(shù)示范課題（XZ201901NA05）。

作者簡介：高磊（1987—），男，甘肅白銀人，碩士，助理研究員，從事食用菌培養(yǎng)等方向的研究。E-mail： 1173835491@qq.com。