黃曉潤，郭婭，黎忠杰，曾金興，吳擁軍

(貴州大學 生命科學學院，貴陽 550025)

水豆豉是以大豆為原料，經浸泡、蒸煮、制曲、發(fā)酵等工藝加工而成[1]，具有極高營養(yǎng)價值和醫(yī)療價值的豆制品[2]。水豆豉是利用細菌等多種微生物發(fā)酵而成的食品[3]，其微生物主要有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、乳酸菌(Lactobacillus)和微球菌(Micrococcus)[4-6]。因豉香誘人，同時具有極高的營養(yǎng)價值[7]，以及抗氧化、降血糖、降血壓、預防骨質疏松、溶栓、防癌等生理功效[8-12]，因此，水豆豉逐漸受到消費者的喜愛，并引起了科研人員的興趣[13]。

但是由于水豆豉的生產方式至今仍較落后，生產周期較長，導致其生產品質不穩(wěn)定，隨著食用人群的增多，隨之出現(xiàn)的豆豉安全性問題也逐漸增多，備受消費者與研究人員的關注[14]，目前關于自然發(fā)酵型水豆豉的細菌菌群動態(tài)變化的研究鮮有報道。

研究應用DGGE-PCR技術對貴州某工廠生產的自然發(fā)酵型水豆豉進行細菌菌群的動態(tài)監(jiān)測研究，這對掌握自然發(fā)酵型水豆豉生產過程中食源性致病菌的動態(tài)變化，評估其生物安全性以及指導生產控制具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)、95%乙醇、鹽酸：重慶川東化工有限公司；檸檬酸氫二銨([(NH4)2HC6H5O7])：湖北興銀河化工有限公司；結晶紫：湖北大學化工廠；Na2EDTA·2H2O(ethylene diamine tetraacetic acid)、丙烯酰胺(acrylamide)、去離子甲酰胺(formamide deionized)、TEMED(N,N,N,N-tetramethylethylenediamine)：AMRESCO公司。

自然發(fā)酵豆豉樣本：采集自貴陽某工廠曲房，制曲期間每隔6 h采集一次，采集3 d。后發(fā)酵每隔1 d采樣一次，采集7 d。

E.coliBL21(DE3)為本實驗室保藏菌種；測序載體pGEM-T Easy Vector System I購自Promega公司。

1.2 儀器與設備

標準型凈化工作臺 上海錦星科學儀器有限公司；VORTEX-GENIE2漩渦混合器 基因有限公司；XSZ-G生物顯微鏡 泰克儀器有限公司；GMSX-280高壓滅菌鍋 英國阿斯太歐(Astell)公司；DCodeTMUniversal Mutation Detection System、C1000 TouchTMThermal Cycler、Universal Hood Ⅱ凝膠成像分析儀 Bio-Rad公司；Applied Biosystems Veriti 96 Well Thermal Cycler PCR儀 AB公司。

1.3 方法

1.3.1 自然發(fā)酵接種

剛蒸煮的黃豆，帶上手套不停翻涼至40 ℃后，做好標記，放置于曲房。

1.3.2 宏基因組的提取

豆豉樣本宏基因組DNA提取采用Takara Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒提取基因組。樣品預處理過程：取5 g豆豉于45 mL無菌PBS(pH 7.2)緩沖液中，120 r/min，30 min；吸取1 mL菌懸液，500 r/min，離心10 min。室溫靜置30 min，管底有沉淀；移上清液至新EP管中，12000 r/min，離心5 min，棄上清得沉淀；分別吸取500 μL滅菌生理鹽水，重懸菌體之后再補500 μL無菌PBS緩沖液，顛倒混勻，12000 r/min，5 min，重復2次。沉淀再用無菌TE緩沖液(pH 8.0)重懸菌體2次，將沉淀移置于另一EP管中。

1.3.3 引物設計及PCR擴增

選取幾對細菌通用引物登錄NCBI進行比對，所用引物見表1。

表1 細菌PCR引物Table 1 The bacterial PCR primers

注：GC clamp*序列-CGCCCGCCGCGCGCCGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG。

采用降落式PCR(Touchdown PCR)，其反應體系為：10×PCR Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、Primer F with GC 1 μL、Primer R 1 μL、Template 1 μL、Taq 0.25 μL、UPW 37.25 μL。反應程序： 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；68 ℃(每降0.5 ℃ 1個循環(huán)) 30 s；72 ℃ 30 s；94 ℃ 30 s，20個循環(huán)；58 ℃ 30 s；20個循環(huán)，72 ℃ 1 min，72 ℃ 7 min，1個循環(huán)；4 ℃，∞。

1.3.4 DGGE凝膠電泳及圖譜分析

參照Muyzer等[15]的方法，對細菌16S rDNA 的擴增產物進行DGGE分析。電泳結束后用 Quantity One(Bio-Rad)進行條帶數(shù)、多樣性及粗定量分析。

1.3.5 DGGE切膠回收及克隆測序

切取目的片段，加ddH2O，于4 ℃ 過夜保存。取1 μL上清液作為模板，進行PCR擴增，采用Omego試劑盒回收純化，與載體連接后，轉化至感受態(tài)細胞過夜培養(yǎng)。經質粒PCR鑒定，取陽性質粒送至寶生物工程(大連)有限公司。

2 結果與分析

2.1 宏基因組的提取

圖1 制曲期間自然發(fā)酵豆豉基因組圖Fig.1 Genetic diagram of naturally fermented soya beans during koji making

注：泳道M表示DL15000 DNA marker;泳道1～12表示水豆豉發(fā)酵時間分別為 0，6，12，18，24，30，36，42，48，54，60，66 h。

圖2 后發(fā)酵期間自然發(fā)酵基因組圖Fig.2 Genetic diagram of naturally fermented soya beans during post fermentation

注：泳道M表示DL15000 DNA marker; 泳道1～7表示水豆豉發(fā)酵時間分別為1，2，3，4，5，6，7 d。

由圖1和圖2可知，自然發(fā)酵制曲和后發(fā)酵期間，條帶都較為完整，片段大小至少大于15000 bp，可進行下一步PCR擴增?；蚪M提取，片段明亮且較為完整，片段大小至少大于15000 bp，適應于進行后續(xù)實驗和PCR擴增。

2.2 PCR擴增細菌16S rDNA基因組27F-1492R

圖3 制曲期間自然發(fā)酵水豆豉27F-1492R擴增Fig.3 27F-1492R PCR amplification of naturally fermented soya beans during koji making

注：泳道M表示DL2000 DNA marker; 泳道1～12表示水豆豉發(fā)酵時間分別為 0，6，12，18，24，30，36，42，48，54，60，66 h。

圖4 后發(fā)酵期間自然發(fā)酵水豆豉27F-1492R擴增Fig.4 27F-1492R PCR amplification of naturally fermented soya beans during post fermentation

注：泳道M表示DL2000 DNA marker;泳道1～7表示水豆豉發(fā)酵時間分別為1,2,3,4,5,6,7 d。

由圖3和圖4可知，自然發(fā)酵型水豆豉用16S rDNA基因組引物27F-1492R擴增出目的條帶，大小為1465 bp，條帶單一，滿足后續(xù)細菌V3區(qū)擴增試驗對樣品DNA質量要求。

2.3 PCR擴增細菌V3區(qū)

圖5 制曲期間自然發(fā)酵豆豉細菌V3區(qū)PCR擴增Fig.5 V3 PCR amplification of naturally fermented soya beans during koji making

注：泳道M表示DL2000 DNA marker;泳道1～12表示水豆豉發(fā)酵時間分別為 0，6，12，18，24，30，36，42，48，54，60，66 h。

圖6 后發(fā)酵期間自然發(fā)酵豆豉細菌V3區(qū)PCR擴增Fig.6 V3 PCR amplification of naturally fermented soya beans during post fermentation

注：泳道M表示DL2000 DNA marker；泳道1～7表示水豆豉發(fā)酵時間分別為1,2,3,4,5,6,7 d。

由圖5和圖6可知，以總DNA產物為模板，采用降落式PCR程序進行細菌16S rDNA V3可變區(qū)的擴增，所有樣品均擴增出堿基長度約為250 bp，目標條帶單一，滿足后續(xù)DGGE試驗對樣品DNA質量要求。

2.4 自然發(fā)酵型水豆豉不同階段DGGE結果

自然發(fā)酵型水豆豉不同階段DGGE結果見圖7。

圖7 自然發(fā)酵水豆豉DGGE結果Fig.7 The DGGE result of naturally fermented soya beans

注：條帶CK表示未發(fā)酵樣品；條帶1～11表示水豆豉發(fā)酵時間分別為6，12，18，24，30，36，42，48，54，60，66 h;條帶12～18表示水豆豉后發(fā)酵時間分別為1，2，3，4，5，6，7 d。

制曲期間發(fā)酵6～48 h、后發(fā)酵54 h～7 d鑒定結果見表2。

表2 制曲期間發(fā)酵6～48 h、后發(fā)酵54 h～7 d鑒定結果Table 2 The identification results of fermenting for 6～48 h during koji making and 54 h～7 d during post fermentation

續(xù) 表

不同發(fā)酵時間條帶數(shù)統(tǒng)計見圖8。

圖8 不同發(fā)酵時間條帶數(shù)統(tǒng)計Fig.8 The bands statistics of different fermentation time

PCR-DGGE技術分離出16種微生物(見圖9)，其中豆子樣本(CK)中，Serratiamarcescens、枯草芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、Alcaligenesfaecalis是豆豉未發(fā)酵，剛放進曲房存在的微生物。嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)以及熱噬淀粉芽孢桿菌的存在是因為豆豉發(fā)酵環(huán)境中，曲溫達到 50 ℃左右，適宜嗜熱細菌的生長，而其他一些不適宜高溫的微生物則被抑制。其中，人參土芽孢桿菌(Bacillusginsengihumi)僅出現(xiàn)在發(fā)酵42～48 h。

自然發(fā)酵制曲后期及后發(fā)酵時期，特有的微生物有索諾拉沙漠芽孢桿菌(Bacillussonorensis)、地衣芽孢桿菌。叢毛單胞菌屬(Comamonasjiangduensis)只存在后發(fā)酵5～6 d。

圖9 自然發(fā)酵水豆豉CK～48 h、54 h～7 d細菌分布Fig.9 The bacterial distribution of naturally fermented soya beans at CK～48 h, 54 h～7d

3 討論

通過PCR-DGGE鑒定，枯草芽孢桿菌自然發(fā)酵豆豉在制曲階段的18條條帶中，有12條屬于枯草芽孢桿菌屬，后發(fā)酵階段的19條條帶中，有11條屬于枯草芽孢桿菌屬，證實了枯草芽孢桿菌的數(shù)量及種類具有絕對優(yōu)勢，為主酵微生物?？莶菅挎邨U菌屬中，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)以及熱噬淀粉芽孢桿菌(Bacillusthermoamylovorans)貫穿整個發(fā)酵過程中，且從條帶亮度判斷，大量存在。

在貴州自然發(fā)酵型水豆豉過程中，發(fā)現(xiàn)了(條件)致病菌，如奇異變形桿菌，這在國內外豆豉微生物分離鑒定的報道中，第一次在貴州自然發(fā)酵型水豆豉中分離得到，其中還包括蠟樣芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，存在于豆豉后發(fā)酵1～7 d期間。蠟樣芽孢桿菌是常見的食品污染菌和條件致病菌，污染的食物主要為含淀粉較多的各類食物[16]，同時還檢測到糞腸球菌(Enterococcusfaecium)，其具有較強的產酪胺和苯乙胺能力[17]，變形桿菌屬可產組胺，球腸菌屬可產酪胺，沙雷氏菌屬可產腐胺。推測豆豉發(fā)酵過程中，芽孢桿菌屬、奇異變形桿菌、居泉沙雷菌以及屎腸球菌與貴州水豆豉生物胺產生息息相關。

糞產堿菌(Alcaligenesfaecalis)可以抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、變形桿菌(Proteusbacillusvulgaris)等微生物，通常對人體無害，可致病，引起腸炎、尿路感染，大多不嚴重。研究分離出來的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、納豆芽孢桿菌(B.natto)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)是目前可利用于生物防治領域的菌株，在貴州自然發(fā)酵型水豆豉中上述菌株為主要發(fā)酵菌株。

以上說明自然發(fā)酵型水豆豉目前存在潛在的食品安全問題，分析可以通過添加輔料、控制發(fā)酵條件或控制生產環(huán)境來抑制甚至殺死原料中本身帶有的致病菌或條件致病菌，本研究對貴州自然發(fā)酵型水豆豉的分析以及對其致病菌的防控具有重要意義。同時，枯草芽孢桿菌屬與其他菌屬是否具有拮抗作用的研究，從細菌菌群演變情況監(jiān)測水豆豉生物胺的含量，不同地區(qū)豆豉樣本的差異還可進一步研究。

4 結論

研究通過PCR-DGGE技術在貴州傳統(tǒng)自然發(fā)酵型水豆豉中鑒定，枯草芽孢桿菌的數(shù)量及種類具有絕對優(yōu)勢，為主酵微生物。共有的種群包含枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)以及熱噬淀粉芽孢桿菌(Bacillusthermoamylovorans)。研究表明，貴州水豆豉中微生物多樣性較高，研究結果為探索特色水豆豉的安全標準化生產加工及其生物安全性提供了參考。